【摘要】：胚胎期和哺乳期是機(jī)體發(fā)育的重要時(shí)期,從生命的起源到發(fā)育成型要經(jīng)歷細(xì)胞增殖、分化、遷移和程序性調(diào)亡等一系列復(fù)雜的過(guò)程。上世紀(jì)90年代末,英國(guó)學(xué)者提出“成人疾病的宮內(nèi)起源”假說(shuō),該觀點(diǎn)發(fā)布后引起國(guó)內(nèi)外廣泛關(guān)注,學(xué)者們認(rèn)為圍產(chǎn)期經(jīng)歷的環(huán)境對(duì)于成年后健康影響巨大,可能影響機(jī)體成年后患心血管疾病、代謝性疾病和腎臟疾病等各種慢性非傳染性疾病的風(fēng)險(xiǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)宮內(nèi)發(fā)育進(jìn)程中胎盤功能不全、母體低蛋白質(zhì)飲食、糖皮質(zhì)激素暴露和高脂飲食等因素都會(huì)影響先天腎臟發(fā)育,可能會(huì)導(dǎo)致胎兒和新生兒腎單位數(shù)量降低,增加成年后疾病負(fù)擔(dān)。 鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(Di-(2-ethylhexyl)-phthalate, DEHP),是生產(chǎn)聚氯乙烯產(chǎn)品中廣泛使用的一種增塑劑,可以通過(guò)消化道、呼吸道及皮膚接觸等途徑進(jìn)入人體。DEHP及其在體內(nèi)的主要代謝產(chǎn)物鄰苯二甲酸單乙基己基酯(Mono(2-ethylhexyl) phthalate, MEHP),均可以通過(guò)胎盤和乳汁進(jìn)入子代體內(nèi),影響胎兒和新生兒的健康。既往關(guān)于DEHP的研究主要集中在短期高劑量暴露上,發(fā)現(xiàn)DEHP可以誘發(fā)肝毒性、睪丸毒性、腎臟毒性、發(fā)育障礙和生殖毒性等�？紤]到MEHP是PPARs受體的激活劑,MEHP通過(guò)與PPARa結(jié)合可以影響能量代謝,與PPARy結(jié)合可能影響細(xì)胞分化。另外,PPARs可以影響糖皮質(zhì)激素和腎素-血管緊張素系統(tǒng)(Renin-angiotensin system, RAS)的功能,從而直接或間接影響輸尿管芽(ureteric bud, UB)在腎發(fā)生過(guò)程中的分支,干擾腎臟發(fā)育進(jìn)程。因此,我們推測(cè)圍產(chǎn)期暴露于DEHP可能會(huì)對(duì)子代大鼠腎臟發(fā)育產(chǎn)生影響。 本研究首先在胚胎期和哺乳期通過(guò)母體將子代間接暴露于DEHP,觀察DEHP對(duì)腎臟發(fā)育的影響,并觀察子代大鼠成年后腎臟和血壓的改變；然后,我們?cè)跀嗳楹蠼o予部分大鼠高脂飲食,觀察圍產(chǎn)期DEHP暴露和成年高脂飲食對(duì)大鼠腎臟損害的協(xié)同作用；此外,選擇腎臟發(fā)育窗口期的胚胎腎臟做基因表達(dá)譜分析,進(jìn)一步探索DEHP損害腎臟發(fā)育的機(jī)制。 第一部分圍產(chǎn)期暴露于DEHP影響子代大鼠腎臟發(fā)育 目的：探討圍產(chǎn)期通過(guò)母體間接暴露于DEHP對(duì)子代大鼠腎臟發(fā)育的影響及可能的機(jī)制。 方法：將孕鼠隨機(jī)分為三組：對(duì)照組、低劑量組和高劑量組。從受孕0天開始直至仔鼠出生后第21天斷乳,分別進(jìn)行玉米油和不同劑量的DEHP(0.25和6.25mg/kg body weight/day)灌胃染毒。測(cè)量子代大鼠體重、腎重、血壓、腎功能等變化；通過(guò)HE染色法、PAS染色和masson染色觀察子代大鼠腎臟病理學(xué)變化,并且通過(guò)電鏡觀察腎臟超微結(jié)構(gòu)變化；采用ELISA、Griss法和免疫組化切片法分別檢測(cè)成年子代大鼠血清腎素、血管緊張素Ⅱ、內(nèi)皮素-1和一氧化氮等血壓調(diào)節(jié)相關(guān)指標(biāo)；同時(shí),采用Q-PCR、western blotting和免疫組化切片法分別檢測(cè)幼年子代大鼠RAS、PPARs、腎臟早期發(fā)育相關(guān)基因和結(jié)構(gòu)相關(guān)基因的變化。 結(jié)果：與對(duì)照組相比,圍產(chǎn)期通過(guò)母體間接暴露于DEHP會(huì)使斷乳期子代大鼠腎單位數(shù)量降低、腎小球體積增大、腎小囊縮小等病理學(xué)改變,成年大鼠逐漸出現(xiàn)腎小球硬化、腎間質(zhì)纖維化、足細(xì)胞足突腫脹甚至消失等病理學(xué)變化。并且,母體暴露于DEHP的子代大鼠成年后血壓顯著升高,RAS功能激活,腎功能顯著降低,表現(xiàn)為內(nèi)生肌酐清除率降低、血尿素氮升高、尿總蛋白升高。并且,腎臟腎素和血管緊張素Ⅱ的蛋白表達(dá)水平在出生時(shí)顯著降低,但在斷乳期顯著升高。此外,母體暴露于DEHP同樣也會(huì)導(dǎo)致腎臟分化關(guān)鍵基因Foxdl, Gdnf, Pax2和Wnt11的mRNA表達(dá)水平在出生時(shí)顯著降低；腎臟發(fā)育結(jié)構(gòu)相關(guān)基因Bmp4, Cdh11, Calm1和Ywhab的mRNA表達(dá)水平在出生時(shí)顯著升高。 結(jié)論：母體DEHP暴露將會(huì)影響子代大鼠腎臟發(fā)育,導(dǎo)致腎單位數(shù)量降低,以致成年后大鼠腎功能損害和血壓升高。研究表明母體暴露于DEHP通過(guò)抑制子代RAS功能,影響腎單位發(fā)育和成年腎臟疾病。 第二部分圍產(chǎn)期暴露于DEHP加劇子代子代高脂飲食誘導(dǎo)的腎損害 目的：第一部分研究顯示圍產(chǎn)期暴露于DEHP可以影響子代大鼠腎臟發(fā)育,在本部分,我們引入高脂高糖的暴露因素,進(jìn)一步探討圍產(chǎn)期暴露于DEHP與子代斷乳后高脂飲食暴露的協(xié)同效應(yīng)及可能的影響機(jī)制。 方法：將孕鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和試驗(yàn)組,從受孕0天開始直至仔鼠出生后第21天斷乳,分別進(jìn)行玉米油和DEHP (1.25mg/kg body weight/day)灌胃染毒。每組斷乳后,子代被隨機(jī)分為兩個(gè)亞組,給予正常飲食(Normal diet, ND)或高脂飲食(High fat diet, HFD)。測(cè)量子代大鼠體重、腎重、血壓、腎功能等的變化；通過(guò)HE染色法、PAS染色和masson染色觀察子代大鼠腎臟病理學(xué)變化；同時(shí),采用Q-PCR、western blotting和免疫組化切片分別檢測(cè)成年及幼年子代大鼠RAS系統(tǒng)、PPARs、腎臟早期發(fā)育相關(guān)基因和結(jié)構(gòu)相關(guān)基因的變化。 結(jié)果：研究發(fā)現(xiàn),圍產(chǎn)期暴露于DEHP會(huì)降低出生時(shí)子代大鼠腎單位的數(shù)量,增加腎臟PPARs蛋白質(zhì)的表達(dá),降低腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)蛋白質(zhì)的表達(dá)。在成年期,如預(yù)期一樣,高脂飲食顯著增加大鼠的體重和血壓。另外,DEHP或高脂飲食均可引起子代大鼠腎功能不全和腎小球硬化,并且同時(shí)暴露于DEHP和高脂飲食的子代大鼠腎臟損害現(xiàn)象最為嚴(yán)重。此外,圍產(chǎn)期DEHP暴露會(huì)使高脂飲食暴露的子代大鼠腎臟PPARs蛋白的表達(dá)降低,RAS和TGFβ1蛋白的表達(dá)增加。 結(jié)論：通過(guò)圍產(chǎn)期間接暴露于DEHP與斷乳后高脂飲食對(duì)于子代大鼠的腎損害具有協(xié)同效應(yīng)。其影響原因可能是暴露于DEHP后,一方面降低子代腎單位數(shù)量,使腎臟功能過(guò)度代償；另一方面使子代PPARs功能失調(diào),腎臟自我保護(hù)能力降低。 第三部分胚胎期DEHP暴露對(duì)大鼠腎臟發(fā)育窗口期腎臟基因表達(dá)譜的影響 目的：分析暴露于DEHP對(duì)子代大鼠腎臟發(fā)育窗口期腎臟基因表達(dá)譜的影響,進(jìn)一步探索胚胎期DEHP暴露對(duì)腎臟發(fā)育可能的影響機(jī)制。 方法：將孕鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和試驗(yàn)組,從受孕0天開始分別進(jìn)行玉米油和DEHP (0.25mg/kg body weight/day)灌胃染毒。在胚胎期14.5天和16.5天分別處死一批孕鼠取胚胎,分別標(biāo)記為E14.5-C(胚胎期14.5天對(duì)照組)、E14.5-D(胚胎期14.5天DEHP組)、E16.5-C(胚胎期16.5天對(duì)照組)與E16.5-D(胚胎期16.5天DEHP組)。部分胚胎做HE染色觀察腎臟的病理學(xué)改變,部分胚胎分離腎臟,提取腎臟RNA,制成混合樣本應(yīng)用表達(dá)譜分析技術(shù),篩選差異表達(dá)基因,并對(duì)其進(jìn)行聚類分析、Gene Ontology功能顯著性富集分析和Pathway顯著性富集分析。 結(jié)果：胚胎期暴露于DEHP會(huì)導(dǎo)致子代大鼠腎臟發(fā)育不良。DEHP組與對(duì)照組相比,在E14.5天子代大鼠腎臟基因表達(dá)差異比E16.5天顯著。并且,E14.5-D與E14.5-C的差異基因,和E16.5-C與E14.5-C與之間的差異基因變化規(guī)律相似；E16.5-D與E16.5-C的差異基因,和E16.5-D與E14.5-D之間的差異基因變化規(guī)律相似。另外,E14.5-D與E14.5-C的差異基因主要集中在細(xì)胞內(nèi),E16.5-D與E16.5-C的差異基因主要集中在細(xì)胞外區(qū)域,E16.5-C與E14.5-C的差異基因主要集中在細(xì)胞內(nèi),E16.5-D和E14.5-D的差異基因主要集中在收縮纖維。另外,E14.5-D與E14.5-C、E16.5-C與E14.5-C在PPAR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、代謝等通路發(fā)生了變化,E16.5-D與E16.5-C在凋亡、黏附等通路發(fā)生了變化,E16.5-D與E14.5-D在蛋白質(zhì)的消化吸收等通路發(fā)生了變化。 結(jié)論：我們認(rèn)為E14.5比E16.5腎臟發(fā)育更敏感,胚胎期DEHP暴露通過(guò)參與腎臟發(fā)育關(guān)鍵期PPAR通路、Wnt通路、糖脂代謝、凋亡等及相關(guān)信號(hào)通路,降低了基因的敏感性,影響了細(xì)胞、器官及系統(tǒng)的發(fā)育進(jìn)程,導(dǎo)致胚胎大鼠腎臟發(fā)育速度加快,腎單位發(fā)育不足。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R114

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本文編號(hào)：2347291