【摘要】：鄰苯二甲酸二(2—乙基)己酯(Di-(2-ethylhexyl) phthalate, DEHP)是塑料工業(yè)中使用最廣泛的一類增塑劑,它主要用來增加塑料的彈性和柔韌性。由于DEHP在塑料中以非共價鍵形式存在,并可隨著使用時間的推移而不斷釋放至大氣、土壤和水體中,人體可通過呼吸道、消化道和皮膚多途徑持續(xù)地暴露于環(huán)境中的DEHP。為此,DEHP的潛在健康危害已倍受國內(nèi)外學者的關(guān)注。 研究表明,進入機體的DEHP很快被代謝為活性中間產(chǎn)物—鄰苯二甲酸單(2-乙基己基)酯mono-(2-ethylhexyl) phthalate, MEHP),產(chǎn)生肝臟毒性、腎臟毒性和生殖發(fā)育毒性等。體外研究顯示,MEHP可致多種細胞的凋亡,但尚不了解其分子調(diào)控機制。 MEHP是過氧化物酶體增殖物(peroxisome proliferators, PP),它可經(jīng)氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferators activated receptors, PPAR)介導肝毒性。但是,MEHP致肝毒性的調(diào)控機制并非完全依賴PPAR途徑,可能與孕烷X受體(pregnane X receptor, PXR)有一定的關(guān)聯(lián)。 細胞凋亡是外環(huán)境刺激或死亡信號所觸發(fā)的細胞主動死亡過程,該過程受多個基因的調(diào)控,其中抑癌基因p53發(fā)揮主要調(diào)控作用。活化p53通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控下游凋亡基因,如bax-, bcl-2和puma等激活線粒體凋亡通路引起細胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn),在MEHP引起的生殖細胞凋亡過程中有p53蛋白的高表達。但是,細胞凋亡并非僅受p53介導的細胞信號通路的調(diào)控,p53非依賴信號通路,如c-Jun氨基末端激酶-促分裂素原活化蛋白激酶(c-Jun N-terminal kinases-mitogen activated protein kinases, JNK-MAPK)途徑和Fas/FasL途徑等也可參與其調(diào)控。不過迄今仍不清楚在MEHP致肝細胞凋亡中p53依賴性和非依賴性信號通路是否參與了調(diào)控。 基于此,本研究擬用MEHP處理人胚肝細胞L02和人肝癌細胞HepG2來研究MEHP致肝細胞毒性和氧化損傷變化,以及p53介導的線粒體通路在MEHP致肝細胞凋亡中的調(diào)控機制,并探索性研究Fas/FasL在p53非依賴性信號通路調(diào)控MEHP致肝細胞凋亡中的作用,旨在為后續(xù)深入研究MEHP致肝細胞毒性的分子機制提供科學依據(jù)。本研究包括以下三個部分： 第一部分MEHP致人肝細胞氧化性DNA損傷和細胞凋亡的研究 目的：建立MEHP染毒L02細胞和HepG2細胞模型。方法：MEHP設定濃度為6.25μM、12.50μM、25.00μM、50.00μM和100.00μM,二甲基亞砜(DMSO)為溶劑對照(終濃度≤0.1%),檢測內(nèi)容包括：①MTT檢測細胞活力；②試劑盒檢測細胞丙二醛(maleic dialdehyde, MDA)水平、超氧化物酶(superoxide dimutese, SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)的活性；③高效液相色譜儀(HPLC)檢測細胞8-羥基-2’-脫氧鳥苷(8-hydroxy-2'-deoxyguanosine,8-OHdG)水平；④流式細胞儀和TUNEL檢測細胞凋亡變化。研究結(jié)果如下： (一)細胞活力 ①用MEHP處理L02細胞12h,僅在50.00μM處理組檢出細胞活力上升(p0.05)；在24h時點,50.00μM和100.00μM處理組的細胞活力均顯著性降低p0.05或p0.01)；在36h時點,較高濃度MEHP處理組(≥25.00μM)細胞的活力均顯著性降低(p0.05或p0.01)。 ②用MEHP處理HepG2細胞12h,在50.00μM和100.00μM處理組的細胞活力顯著性下降(p0.01)。在24h和36h時點,細胞活力隨MEHP濃度的升高而逐漸降低,在較高濃度的MEHP處理組(≥25.00μM),細胞活力均顯著性降低p0.01)。 (二)細胞的氧化損傷 ①用MEHP處理L02細胞和HepG2細胞12h,在所有處理組均未觀察到MDA水平的變化p0.05)。在24h和36h時點,較高濃度的MEHP處理L02細胞(≥25.00μM)的MDA水平均顯著性升高p0.05或p0.01)。用MEHP處理HepG2細胞24h,所有處理組的MDA水平均顯著性升高(p0.01)；在36h時點,除6.25μM處理組外,所有MEHP處理組的MDA水平均顯著性升高(p0.01)。 ②用MEHP處理L02細胞12h,所有處理組細胞的SOD活性均無顯著性變化(p0.05)；在24h時點,所有處理組細胞的SOD活性均顯著性降低(p0.05或p0.01)；在36h時點,較高濃度MEHP處理組(≥25.00μM)細胞的SOD活性也顯著性降低p0.01)。MEHP處理HepG2細胞12h,所有MEHP處理組細胞的SOD活性均無顯著性變化(p0.05)；在24h時點,僅觀察到100.00μM處理組細胞的SOD活性降低(p0.05)；在36h時點,50.00μM和100.00μM處理組細胞的SOD活性均降低p0.05)。 ③MEHP處理L02細胞12h和24h,所有MEHP處理組均為觀察到細胞GSH-Px活性的變化p0.05)；在36h時點,除6.25μM處理組外,其他處理組細胞的GSH-Px活性均降低p0.05)。用MEHP處理HepG2細胞12h,在所有處理組未觀察到GSH-Px活性的變化(p0.05)；在24h和36h時點,除6.25μM處理組外,其他處理組細胞的GSH-Px活性均顯著性降低p0.05)。 (三)細胞8-OHdG水平 ①MEHP處理L02細胞24h和36h,僅在24h時點的50.00μM和100.00μM處理組和36h時點的100.00μM處理組8-OHdG水平有顯著性升高p0.05或p0.01);②MEHP處理HepG2細胞24h和36h,在24h時點25.00μM的各處理組和36h時點的100.00μM處理組細胞的8-OHdG水平有顯著性升高p0.05或p0.01)。 (四)細胞凋亡 ①流式細胞儀檢測結(jié)果顯示：MEHP處理L02細胞24h和36h,在50.00μM和100.00μM處理組的細胞凋亡率均顯著性增加(p0.01)。MEHP處理HepG2細胞24h和36h,觀察到24h時點100.00μM處理組和36h時點25.00μM各處理組的細胞凋亡率顯著性增加(p0.01)。 ②TUNEL結(jié)果顯示：MEHP處理L02細胞24h和36h,50.00μM和100.00gM處理組有綠色熒光標記的凋亡細胞數(shù)明顯增多。MEHP處理HepG2細胞24h,僅發(fā)現(xiàn)100.00μM組綠色熒光標記的凋亡細胞略有增多；在36h時點,在25.00μM處理組已發(fā)現(xiàn)綠色熒光標記的凋亡細胞數(shù)有明顯增多。 結(jié)論：MEHP可致L02細胞和HepG2細胞氧化應激和氧化性DNA損傷,并導致細胞凋亡。 第二部分p53介導線粒體通路在MEHP致肝細胞凋亡中的調(diào)控作用 第一部分研究結(jié)果提示：MEHP并非完全依賴于PPAR途徑致肝細胞凋亡。因此,本部分將進一步研究PXR受體途徑的相關(guān)基因、蛋白質(zhì)表達水平和酶活性的變化,以及p53介導線粒體通路在MEHP致L02細胞和HepG2細胞凋亡中的調(diào)控作用。方法：MEHP設定濃度為6.25μM、12.50μM、25.00μM、50.00μM和100.00μM,二甲基亞砜(DMSO)為溶劑對照(終濃度≤0.1%),檢測內(nèi)容包括：①實時熒光定量RT-PCR檢測pxr基因mRNA表達；②estern blotting檢測CYP3A4蛋白表達,7-乙氧基香豆素O-去乙基酶(ECOD)檢測CYP3A4酶活性；③estern blotting檢測p53、p-p53、MDM2、 Bax、Bcl-2、PUMA和NOXA蛋白表達；④HPLC檢測細胞ATP含量；⑤Westem blotting檢測胞漿內(nèi)Cytochrome c和Smac/DIABLO蛋白含量；⑥試劑盒檢測caspase3,9酶活性。研究結(jié)果如下： (一)PXR受體途徑相關(guān)基因、蛋白及酶活性 ①MEHP處理L02細胞24h,除6.25μM組外,其他處理組pxr基因的mRNA表達均被上調(diào)(p0.05或p0.01)。在36h時點,所有處理組pxr基因的mRNA表達均被上調(diào)(p0.05或p0.01)。MEHP處理HepG2細胞24h,在25.00μM的各處理組pxr基因mRNA表達均被上調(diào)(p0.05或p0.01)。在3.6h時點,除6.25μM處理組外,其他處理組pxr基因mRNA表達均被上調(diào)(p0.01)。 ②MEHP處理L02細胞24h,50.00μM和100.00μM處理組CYP3A4蛋白表達量增加p0.01)。在36h時點,除6.25μM處理組外,其他處理組CYP3A4蛋白表達量均增加(p0.05或p0.01)。MEHP處理HepG2細胞24h,除6.25μM處理組外,其他處理組CYP3A4蛋白表達量增加(p0.05或p0.01)。在36h時點,25.00μM的各處理組CYP3A4蛋白表達均增加(p0.01);③MEHP處理L02細胞24h,50.00μM和100.00gM處理組ECOD酶活性均顯著性升高(p0.05或p0.01)；在36h時點,≥25.00μM的各處理組ECOD活性均顯著性升高(p0.01)。 MEHP處理HepG2細胞24h和36h,所有處理組ECOD活性均顯著性升高(p0.05或p0.01)。 (二)細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達水平 ①MEHP處理L02細胞36h,檢出50.00μM和100.00μM處理組MDM2蛋白表達的下調(diào)(p0.05)；除6.25μM處理組外,其他處理組p53及其磷酸化蛋白均被上調(diào)(p0.05或p0.01)o p53/MDM2比值從12.50μM處理組開始即被上調(diào)(p0.01)。在≥25.00μM的各處理組均檢出Bax蛋白表達上調(diào)(p0.01),但Bcl-2蛋白在50.00μM和100.00μM處理組則下調(diào)p0.05或p0.01)。所有處理組的Bax/Bcl-2比值均升高p0.05或p0.01)o PUMA和NOXA蛋白表達在≥25.00μM的各處理組均被上調(diào)(p0.05或p0.01)。 ②MEHP處理HepG2細胞36h,僅在100μM處理組檢出MDM2蛋白表達下調(diào)(p0.05),而在所有處理組的p53蛋白表達則檢出上調(diào)(p0.05或p0.01),在≥25.00μM的各MEHP處理組均檢出磷酸化p53蛋白表達上調(diào)(p0.01)。所有處理組的p53/MDM2比值均被上調(diào)(p0.01)。僅在100.00μM處理組檢出Bax蛋白表達上調(diào)(p0.05),但在100.00μM處理組則檢出Bcl-2蛋白表達下調(diào)(p0.05)。除6.25μM組外,其他處理組均檢出Bax/Bcl-2比值的升高(p0.05或p0.01)。在≥12.50μM的各MEHP處理組均檢出PUMA和NOXA蛋白表達上調(diào)(p0.05或p0.01)。 (三)細胞線粒體損傷指標 ①MEHP處理L02細胞24h,除6.25μM和12.50μM處理組外,其他處理組的ATP含量均顯著性降低(p0.05或p0.01)。在36h時點,50.00μM和100.00μM處理組ATP含量也顯著性降低(p0.01)。MEHP處理HepG2細胞24h和36h,除36h時點的6.25μM處理組外,其他處理組的ATP含量均顯著性降低(p0.01)。 ②MEHP處理L02細胞36h,所有MEHP處理組的胞漿中細胞色素C(Cytochrome c)的含量均顯著性升高(p0.01)。除6.25μM和12.50μM處理組外,其他處理組胞漿中Smac/DIABLO的含量均顯著性升高(p0.05或p0.01)。MEHP處理HepG2細胞36h,除6.25μM處理組外,其他處理組胞漿中Cytochrome c的含量均升高(p0.05或p0.01),并在所有處理組中均檢出胞漿中Smac/DIABLO的含量的升高(p0.01)。 (四)Caspase3,9酶活性 ①MEHP處理L02細胞36h,在≥25.00μM各處理組的Caspase3和9酶活性均顯著性升高(p0.05或p0.01)。 ②MEHP處理HepG2細胞36h,除6.25μM處理組外,其他處理組的Caspase3和9酶活性均顯著性升高(p0.05或p0.01)。結(jié)論:MEHP上調(diào)L02細胞和HepG2細胞pxr基因的mRNA表達水平,誘導CYP3A4蛋白表達量及其酶活性的增加；誘導p53和促凋亡蛋白(Bax、 NOXA、 PUMA)上調(diào),以及MDM2和Bcl-2蛋白的下調(diào),并激活了線粒體凋亡通路。 第三部分Fas/FasL在p53非依賴性信號通路調(diào)控MEHP致肝細胞凋亡中的作用 第二部分的研究結(jié)果顯示：p53介導了線粒體通路調(diào)控MEHP致肝細胞的凋亡。目的：采用RNA干擾技術(shù)沉默p53,探索性研究p53非依賴性信號通路在MEHP致L02細胞和HepG2細胞凋亡中的調(diào)控作用。方法：MEHP設定濃度為50.00μM和100.00μM,二甲基亞砜(DMSO)為溶劑對照(終濃度≤0.1%),檢測內(nèi)容包括：檢測細胞凋亡率、測定p53、 p-p53、 MDM2、 Bax. Bcl-2、 PUMA、 NOXA、 Fas和FasL蛋白的表達水平、胞漿中Cytochrome c和Smac/DIABLO蛋白含量、以及Caspase3,8,9酶活性。研究結(jié)果如下： (一)L02細胞和HepG2細胞p53基因沉默效率 ①用RNA干擾L02細胞p53基因24h后,用qRT-PCR技術(shù)檢測顯示：p53mRNA表達量相對于陰性對照組的表達量降低83.1%,在處理48h后,p53蛋白表達降低52.5%。 ②用RNA干擾HepG2細胞p53基因24h后,P53mRNA表達量相對于陰性對照組表達量降低81.4%；在處理48h后,p53蛋白表達降低52.4%。 (二)細胞凋亡 ①MEHP處理L02細胞和L02-P53細胞36h,與各自對照組相比,細胞凋亡率均顯著性升高(p0.01)。在相同MEHP處理濃度下,L02-p53細胞凋亡率與L02細胞相比均顯著性升高(p0.01)。 ②MEHP處理HepG2和HepG2-p53細胞36h,與各自對照組相比,細胞凋亡率均顯著性升高(p0.01)。在相同MEHP處理濃度下,HepG2-p53細胞凋亡率與HepG2細胞相比均顯著性升高p0.01)。 (三)細胞凋亡相關(guān)蛋白 ①MEHP處理L02細胞36h,各處理組與對照組相比,p53、p-p53、Bax、PUMA、 NOXA、Fas和FasL蛋白表達均上調(diào)p0.01),但MDM2和Bcl-2蛋白表達均下調(diào)(p0.01)。MEHP處理L02-p53細胞36h,各處理組與對照組相比,MDM2、Bax、PUMA、 NOXA、 Fas和FasL蛋白表達均上調(diào)(p0.01), p53、p-p53和Bcl-2蛋白表達均下調(diào)。同一濃度MEHP處理的L02-p53細胞和L02細胞的結(jié)果比較顯示：L02-p53細胞的MDM2、Fas和FasL蛋白表達均明顯上調(diào)p0.01),而p53和p-p53蛋白則明顯下調(diào)(p0.01),但未檢出Bax、Bcl-2、PUMA和NOXA蛋白表達量的變化(p0.05)。 ②MEHP處理HepG2細胞36h,各處理組與對照組相比,p53、p-p53、Bax、PUMA、 NOXA、Fas和FasL蛋白表達均上調(diào)p0.01),但MDM2和Bcl-2蛋白表達均下調(diào)(p0.01)。 MEHP處理HepG2-p53細胞36h,各處理組與對照組相比,Bax、PUMA、 NOXA、Fas和FasL蛋白表達均上調(diào)(p0.01), Bcl-2蛋白表達均下調(diào)；未檢測到p53、p-p53和MDM2蛋白表達的改變(p0.05)。同一濃度MEHP處理HepG2-p53細胞和HepG2細胞的結(jié)果比較顯示：HepG2-p53細胞的MDM2、Fas和FasL蛋白表達均明顯上調(diào)p0.01),p53和p-p53蛋白表達明顯下調(diào)p0.01),但均未檢出Bax、Bcl-2、PUMA和NOXA蛋白表達量的變化(p0.05)。 (四)胞漿中Cytochrome c和Smac/DIABLO含量 ①MEHP處理L02細胞和L02-p53細胞36h,各處理組與各自對照組相比,胞漿中Cytochrome c含量均顯著性升高p0.01),僅在100.00μM處理組檢出Smac/DIABLO蛋白表達上調(diào)(p0.01)。 ②MEHP處理HepG2細胞和HePg2-P53細胞36h,各處理組與各種對照組相比,僅在100.00μM處理組檢出胞漿Cytochrome c含量顯著性升高p0.01),在所有處理組檢出Smac/DIABLO蛋白表達上調(diào)p0.05或p0.01)。 (五)Caspase3,8,9酶活性 MEHP處理L02細胞、HepG2細胞、L02-p53細胞和HepG2-p53細胞36h,各處理組與各自對照組相比,Caspase3,8,9酶活性均顯著性升高p0.01)。同一濃度MEHP處理L02-P53細胞和L02細胞以及HepG2-p53細胞和HepG2細胞的結(jié)果比較顯示：L02-P53細胞和HepG2-p53細胞各處理組的Caspase3,8,9酶活性均誘導性升高(p0.05或p0.01)。結(jié)論：在MEHP致L02細胞和HepG2細胞凋亡中,p53蛋白介導的細胞信號通路并非為其唯一的調(diào)控機制,Fas/FasL通路可代償p53介導的線粒體通路參與細胞凋亡的調(diào)控。 創(chuàng)新點： 1.發(fā)現(xiàn)p53介導的線粒體凋亡通路參與了MEHP致人肝細胞凋亡的調(diào)控。 2.發(fā)現(xiàn)Fas/FasL凋亡通路可部分代償p53介導的線粒體通路參與MEHP致人肝細胞凋亡的調(diào)控。
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【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R131

【參考文獻】

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本文編號：2344530