發(fā)布時間：2018-11-11 13:46

【摘要】：水體中富營養(yǎng)化程度的增加導(dǎo)致了藍藻水華頻繁發(fā)生,而有毒藍藻水華的爆發(fā)引起了人們越來越多的關(guān)注。目前發(fā)現(xiàn),有毒藍藻水華出現(xiàn)在世界各地的富營養(yǎng)化湖泊、池塘和河流中,引起野生動物和家畜疾病及死亡的發(fā)生。在全球范圍內(nèi),微囊藻毒素(MCs)是淡水水華中最常見、分布最廣的毒素�，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)90余種微囊藻毒素的異構(gòu)體,其中分布最普遍、含量最多的是MC-LR、MC-RR和MC-YR。本文研究了MC-LR對小鼠肝臟組織病理學(xué)、基因、蛋白表達和生化酶活性影響,其中利用HE染色觀察了MC-LR暴露后小鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)的變化;利用實時熒光定量PCR(Q-PCR)、蛋白質(zhì)印跡法(western blot)和分光光度計分析了肝臟功能相關(guān)基因、蛋白和酶的活性變化;利用RNA測序技術(shù)(RNA-seq)分析了MC-LR暴露后小鼠肝臟組織的轉(zhuǎn)錄組;利用酶聯(lián)免疫法(ELISA)分析了MC-LR暴露后小鼠肝臟炎癥反應(yīng)相關(guān)的蛋白變化。獲得了如下幾個方面的實驗結(jié)果:1.MC-LR亞慢性暴露致小鼠肝細胞凋亡急性毒性實驗發(fā)現(xiàn),MC-LR對小鼠腹腔注射的LD50為70μg/kg(56.74-75.6μg/kg)。實驗采用亞致死劑量的MC-LR(3.75、7.5和15μg/kg)連續(xù)腹腔注射暴露小鼠28 d,染毒7、14、21和28 d分別取材檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn),7.5和15μg/kg MC-LR暴露21和28d明顯增加了小鼠血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和天冬氨酸轉(zhuǎn)移酶(AST)活性,而血清堿性磷酸酶(AKP)活性在所有MC-LR處理組暴露28 d時也顯著升高,說明小鼠肝功能受到損傷。同時,MC-LR暴露28 d還引起了小鼠肝臟組織病理學(xué)的改變,如7.5和15μg/kg MC-LR處理組引起肝臟炎細胞浸潤,而15μg/kg MC-LR處理組還誘導(dǎo)了肝細胞凋亡。為了進一步探討MC-LR誘導(dǎo)肝細胞凋亡發(fā)生機理,本實驗又檢測了Bcl-2、Bax、cyt c、caspase 3和caspase 9蛋白。結(jié)果發(fā)現(xiàn),MC-LR暴露28 d后,Bcl-2蛋白含量比對照組明顯下降,而Bax、cyt c、caspase 3和caspase 9蛋白含量升高,表明MC-LR導(dǎo)致的肝細胞凋亡可能通過Bax-cyt c-caspase 9-caspase 3的線粒體通路介導(dǎo)。2.亞慢性MC-LR暴露對小鼠肝臟的氧化損傷及其對Nrf2通路的影響實驗還檢測了MC-LR(3.75、7.5和15μg/kg)暴露28 d對小鼠肝臟的氧化損傷及其對核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)調(diào)控蛋白和酶活性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),處理組Nrf2蛋白含量從MC-LR暴露14 d開始處于持續(xù)升高狀態(tài),表明MC-LR誘導(dǎo)了Nrf2的表達。MC-LR暴露7 d后顯著增加了超氧化物岐化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)酶活性,醌氧化還原酶1(NQO1)、半胱氨酸連接酶催化亞基(GCLC)和血紅素加氧酶1(HO-1)蛋白含量也較對照組增加,這些抗氧化酶和解毒酶活性的增加提高了肝臟清除ROS的能力。隨著暴露時間的延長,盡管谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)活性、GCLC和HO-1蛋白含量依舊高于對照組,但SOD、CAT、GPx活性和NQO1蛋白含量下降,同時T-AOC也顯著下降,表明肝臟抗氧化能力下降。與對照組相比,高劑量組(7.5和15μg/kg)在MC-LR暴露21 d活性氧(ROS)顯著升高,28 d所有處理組均明顯升高。同時,7.5和15μg/kg MC-LR暴露28 d也導(dǎo)致了丙二醛(MDA)含量的升高。結(jié)果表明,Nrf2調(diào)控的抗氧化酶和解毒酶在保護機體免受MC-LR毒性中可能起重要作用。3.MC-LR暴露對小鼠肝臟細胞色素P450代謝酶的影響細胞色素P450(CYP)是Ⅰ相代謝酶的主要成員,其中參與外源性化學(xué)物質(zhì)代謝和生物轉(zhuǎn)化的主要是CYP1、CYP2和CYP3 3個家族。本實驗用低劑量的MC-LR(2、4、和8μg/kg)連續(xù)7 d腹腔注射小鼠染毒,在1、3和7 d取材檢測肝臟CYP1A1、CYP2E1和CYP3A11 m RNA、蛋白和酶活水平變化。結(jié)果表明,MC-LR顯著抑制了小鼠肝臟7-乙氧基異吩惡唑酮脫乙基酶(EROD)活性,但僅2μg/kg MC-LR處理組抑制了小鼠CYP1A1 m RNA表達(1和3 d)。同時,CYP1A1蛋白水平變化和EROD酶活性變化也不一致,表明MC-LR抑制EROD酶活性的機制可能涉及到轉(zhuǎn)錄后和翻譯后水平的調(diào)控。MC-LR暴露上調(diào)小鼠肝臟CYP3A11 m RNA水平,但降低其蛋白含量。同時,MC-LR在整個暴露時間點和暴露劑量組都明顯抑制小鼠紅霉素N-脫甲基酶(ERND)酶活性。MC-LR能顯著增加小鼠肝臟CYP2E1 m RNA、蛋白水平和苯胺羥化酶(ANH)酶活性,表明CYP2E1可能參與了MC-LR在小鼠肝臟中的代謝。而且,MC-LR暴露丙酮誘導(dǎo)CYP2E1高表達小鼠時發(fā)現(xiàn),血清酶ALT、AST活性和肝臟ROS含量和MC-LR處理組相比顯著升高,表明CYP2E1可能在代謝MC-LR時誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS并與MC-LR的肝毒性及其代謝相關(guān)。4.MC-LR暴露后小鼠肝臟轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析為深入探討MC-LR毒性作用的分子機制,我們采用了以RNA-seq技術(shù)為基礎(chǔ)的數(shù)字基因表達譜分析。實驗用10和40μg/kg MC-LR暴露小鼠24 h后檢測處理組和對照組肝臟組織的基因表達譜變化,從中找出差異表達基因(DEGs),用基因本體(GO)和京都基因與基因組百科全書(KEGG)對這些DEGs進行深入分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),10μg/kg處理組有402個基因顯著上調(diào)、38個基因顯著下調(diào);40μg/kg處理組有72個基因顯著上調(diào)、76個基因顯著下調(diào)。GO生物學(xué)過程富集分析發(fā)現(xiàn),10μg/kg MC-LR處理組DEGs顯著富集了10個GO terms,其中和免疫相關(guān)的有innate immune response(GO:0045087),defense response(GO:0006952)和response to bacterium(GO:0009617)。40μg/kg MC-LR處理組DEGs未發(fā)現(xiàn)顯著富集的GO terms。KEGG分析發(fā)現(xiàn),10μg/kg MC-LR暴露后小鼠肝臟DEGs參與的生物學(xué)通路顯著富集了47條,其中和肝臟免疫相關(guān)通路有17條;而40μg/kg MC-LR處理組小鼠肝臟DEGs參與的生物學(xué)通路顯著富集了5條。數(shù)字基因表達譜分析表明,肝臟炎癥反應(yīng)可能在MC-LR毒性中起重要作用。5.MC-LR暴露致小鼠肝臟炎癥反應(yīng)及其機理實驗用5、10、20和40μg/kg MC-LR連續(xù)腹腔注射小鼠染毒7 d,在1、3和7 d時取材檢測。實驗檢測發(fā)現(xiàn),MC-LR暴露小鼠主要誘導(dǎo)了促炎因子IL-6、IL-18和MIF的表達。同時,MC-LR暴露抑制了抑炎因子IL-2表達,促進了IL-4和IL-10的表達。該實驗結(jié)果表明,MC-LR暴露干擾了小鼠肝臟促炎/抑炎平衡,導(dǎo)致肝臟的炎癥反應(yīng)及肝功能損傷。實驗還發(fā)現(xiàn),所有MC-LR處理組均促進Toll樣受體6(TLR6)和TLR9的表達,說明TLR6和TLR9在MC-LR所致小鼠肝臟炎癥反應(yīng)中可能起重要作用。同時,較高劑量MC-LR(40μg/kg)暴露還顯著增加TLR1、TLR2、TLR11和TLR13的表達,說明高劑量的MC-LR急性暴露可能通過誘導(dǎo)/激活大部分TLRs而介導(dǎo)其炎癥反應(yīng)。主要研究結(jié)論1.亞慢性MC-LR暴露引起小鼠肝臟損傷,可能通過線粒體途徑介導(dǎo)細胞凋亡。2.Nrf2通路在保護機體免受MC-LR毒性中起重要作用。3.CYP2E1可能參與肝臟代謝MC-LR,同時代謝過程中會產(chǎn)生過量ROS,對機體造成氧化損傷。4.MC-LR影響小鼠肝臟促炎/抑炎平衡并造成炎癥反應(yīng),可能通過TLRs介導(dǎo)該炎癥反應(yīng)。
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【學(xué)位授予單位】：河南師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R114

【參考文獻】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 尹黎燕;微囊藻毒素對高等植物的生態(tài)生理學(xué)效應(yīng)研究[D];中國科學(xué)院研究生院（水生生物研究所）;2005年

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本文編號：2325008