【摘要】：目的:建立氡染毒和p53敲除人支氣管上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化模型,探討p53在氡致人支氣管上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中,能量代謝途徑的改變及其分子機(jī)制。方法:(1)利用TALEN技術(shù)建立p53敲除人支氣管上皮細(xì)胞模型。(2)建立氡染毒人支氣管上皮(BEAS-2B)細(xì)胞和p53敲除人支氣管上皮(p53 KO)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化模型。細(xì)胞接種于Transwell培養(yǎng)皿置于HD-3型多功能氡室,氡染毒濃度為20000 Bq/m3,染毒時(shí)間20 min/次,細(xì)胞每次氡染毒后培養(yǎng)3-4天,傳代后再進(jìn)行下一輪氡染毒,重復(fù)染毒20次。每5代進(jìn)行一次細(xì)胞增殖活性、軟瓊脂克隆形成、細(xì)胞侵襲和遷移能力的檢測(cè)。(3)在氡暴露致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的不同階段(5、10、15、20、25代),采用生化法檢測(cè)葡萄糖消耗量、乳酸含量、乳酸脫氫酶含量;采用Seahorse XF細(xì)胞外流量分析儀檢測(cè)細(xì)胞氧耗量;采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)ATP含量;real-time PCR檢測(cè)細(xì)胞線粒體DAN拷貝數(shù);JC-1熒光探針流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位;Western blot檢測(cè)p53、SCO2、TIGAR、三羧酸限速酶(IDH3A、SDHA)、糖酵解限速酶(HK-II、PFKM、PKM2)的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果:(1)基因測(cè)序結(jié)果TALEN靶點(diǎn)目的片段出現(xiàn)突變,western blot未檢測(cè)出p53蛋白表達(dá),證實(shí)p53基因敲除細(xì)胞模型建立成功。(2)與野生型p53BEAS-2B細(xì)胞和p53基因敲除細(xì)胞p53 KO細(xì)胞相比,氡染毒后BEAS-2B-Rn和p53 KO-Rn細(xì)胞的軟瓊脂克隆集落數(shù)、細(xì)胞侵襲能力和細(xì)胞遷移率明顯升高,細(xì)胞倍增時(shí)間不同程度減少。同時(shí),BEAS-2B細(xì)胞在氡染毒后第20代開始出現(xiàn)惡性轉(zhuǎn)化,而p53 KO細(xì)胞則提前了5代,即從第15代開始即出現(xiàn)惡性轉(zhuǎn)化表型。(3)氡染毒致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中,細(xì)胞的葡萄糖消耗量明顯增加,乳酸和LDH的含量上升,ATP合成增多,而細(xì)胞氧耗量降低。氡染毒BEAS-2B-Rn細(xì)胞從第10代開始mtDNA拷貝數(shù)增加,并隨著傳代次數(shù)增多而升高。敲除p53基因的p53 KO細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)和MMP均明顯下降,當(dāng)p53 KO-Rn細(xì)胞傳至15代出現(xiàn)惡性轉(zhuǎn)化表型時(shí),mtDNA拷貝數(shù)顯著低于相應(yīng)傳代的BEAS-2B-Rn細(xì)胞。同時(shí),MMP明顯下降。(4)在BEAS-2B-Rn細(xì)胞中,P53蛋白的表達(dá)量從第15代時(shí)出現(xiàn)下降。氡染毒早期,BEAS-2B-Rn細(xì)胞中SCO2和TIGAR的蛋白表達(dá)量無明顯改變,但在20代時(shí)出現(xiàn)蛋白表達(dá)量的下降。在p53 KO細(xì)胞中,SCO2和TIGAR蛋白表達(dá)量低于BEAS-2B細(xì)胞,染氡后SCO2蛋白表達(dá)持續(xù)增加,從第20代開始出現(xiàn)下降,TIGAR蛋白則在染氡后無明顯變化。(5)氡染毒后的BEAS-2B-Rn細(xì)胞從20代開始IDH3A和SDHA蛋白的表達(dá)量下降,p53敲除后SDHA表達(dá)明顯下降,但對(duì)IDH3A表達(dá)無影響。在氡染毒早期,BEAS-2B-Rn細(xì)胞HK-II蛋白表達(dá)增加,并持續(xù)到25代。PFKM蛋白則從20代開始表達(dá)量增加。PKM2蛋白從第15代開始,隨著染氡時(shí)間的延長(zhǎng),表達(dá)量逐漸升高。p53 KO細(xì)胞PFKM蛋白表達(dá)高于BEAS-2B細(xì)胞;在p53 KO-Rn細(xì)胞中,HK-II、PFKM和PKM2的表達(dá)未發(fā)生相應(yīng)的改變。結(jié)論:(1)成功建立了p53基因敲除的人支氣管上皮細(xì)胞模型;(2)成功建立了氡染毒致人支氣管上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的模型;(3)利用上述模型,研究了氡致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中能量代謝的分子改變,發(fā)現(xiàn)氡照射誘導(dǎo)的細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化,是線粒體損傷、能量代謝途徑改變和p53功能喪失綜合作用的結(jié)果。P53對(duì)線粒體能量代謝的失調(diào)是氡致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中的重要影響因素。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R114

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本文編號(hào)：2323978