發(fā)布時(shí)間：2018-11-09 20:03

【摘要】：多糖是紅棗中最重要的活性成分之一，具有較高的藥用價(jià)值。對(duì)紅棗多糖進(jìn)行分子修飾和改性有助于提高和改善其生物活性，拓寬應(yīng)用范圍，同時(shí)也為進(jìn)一步探索紅棗多糖構(gòu)效關(guān)系和豐富多糖構(gòu)效關(guān)系理論積累基礎(chǔ)資料。為此，本論文在對(duì)紅棗多糖進(jìn)行提取和分離純化的基礎(chǔ)上，將分子修飾技術(shù)應(yīng)用到紅棗多糖研究中，通過(guò)超聲處理、鹽酸降解和硫酸酯化、羧甲基化及乙�；揎棧M(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行分子修飾和改性，并采用體外試驗(yàn)法研究了紅棗多糖及其分子修飾產(chǎn)物的抗氧化活性、降血糖作用以及對(duì)透明質(zhì)酸酶的抑制作用，證實(shí)紅棗多糖對(duì)α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶及透明質(zhì)酸酶和非酶糖化反應(yīng)具有抑制作用，分子修飾可顯著改變紅棗多糖的生物活性，且這種改變更多的與分子修飾導(dǎo)致的紅棗多糖高級(jí)結(jié)構(gòu)的變化有關(guān)。具體結(jié)果如下： 一、紅棗多糖制備 1、熱水浸提法提取紅棗多糖的適宜條件為：料液比1:10、溫度80℃、時(shí)間1h、提取2次。采用XAD-761樹(shù)脂吸附法可有效分離紅棗多糖提取液中的多酚物質(zhì)，而且不影響紅棗多糖的提取分離效果，達(dá)到了聯(lián)合提取紅棗多酚、多糖的目的。 2、Sevag法可有效脫除紅棗多糖中的蛋白質(zhì)，活性炭脫色造成的多糖損失率較高。大孔吸附樹(shù)脂對(duì)紅棗多糖具有較好的脫色效果，而且可以重復(fù)使用，是紅棗多糖的較佳脫色方法。 3、采用DE52纖維素柱層析法可將紅棗多糖分級(jí)純化為1個(gè)中性多糖組分和3個(gè)酸性多糖組分，平均分子量均在1000kDa左右，其中酸性多糖組分ZJP-2為紅棗多糖中的主要組分。通過(guò)HPLC分析和高碘酸氧化研究紅棗多糖的單糖組成和連接鍵型，結(jié)果表明，紅棗多糖是由半乳糖醛酸、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖、葡萄糖等組成的雜多糖，主要連接鍵型為1→4糖苷鍵連接。 二、紅棗多糖的分子修飾 1、超聲處理可引起紅棗多糖的降解。較低的溫度、較高的超聲功率、較低的多糖溶液濃度和變頻處理有利于多糖的超聲降解。在試驗(yàn)條件下，超聲處理僅使紅棗多糖分子量得到一定程度的降低，超聲降解后紅棗多糖的平均分子量仍在300kDa以上。鹽酸降解可大幅降低紅棗多糖的分子量，并隨鹽酸濃度的增加而增強(qiáng)。在一定鹽酸濃度條件下得到的紅棗多糖降解產(chǎn)物仍為相對(duì)均一的多糖。過(guò)氧化氫可強(qiáng)烈降解紅棗多糖，但其分子量分布很寬，并且存在大量的小分子糖。 2、采用氯磺酸-吡啶法可成功對(duì)紅棗多糖進(jìn)行硫酸酯化修飾，其最佳工藝條件為：氯磺酸與吡啶的體積比1:3，反應(yīng)溫度60℃，反應(yīng)時(shí)間2.5h，在此條件下制備得到的紅棗多糖硫酸酯的硫酸基取代度可以達(dá)到1.39。 3、采用氫氧化鈉-氯乙酸反應(yīng)體系對(duì)紅棗多糖進(jìn)行羧甲基化修飾，產(chǎn)物的羧甲基取代度隨著反應(yīng)體系中NaOH濃度的增加而提高，但得率呈下降趨勢(shì)，呈明顯負(fù)相關(guān)關(guān)系。在使反應(yīng)液的pH保持在最適條件下的同時(shí)，適當(dāng)增大羧甲基化試劑與紅棗多糖的比例，有利于羧甲基取代度的增加。在試驗(yàn)條件下，制備得到的羧甲基化紅棗多糖的羧甲基取代度最高可達(dá)到0.22。 4、用冰醋酸法和乙酸酐法均可對(duì)紅棗多糖進(jìn)行乙�；揎棥Ｓ帽姿岱ㄖ苽涞囊阴；t棗多糖的取代度較低，因此不適用于高乙�；〈鹊囊阴；揎�。高溫和低pH條件不利于乙酸酐法對(duì)紅棗多糖的乙酰化修飾，在室溫條件下保持反應(yīng)液的pH為9.5±0.5，可以較好地實(shí)現(xiàn)紅棗多糖的乙�；揎棥Ｔ谠囼�(yàn)條件下，制備得到的乙�；t棗多糖的乙酰基取代度最高可達(dá)到0.29。 5、紅棗多糖的硫酸酯化、羧甲基化和乙酰化修飾均可明顯改善其在水溶液中的分布狀態(tài)，提高其溶解性。 三、紅棗多糖及其分子修飾產(chǎn)物的生物活性研究 1、抗氧化活性 紅棗多糖及其經(jīng)DE52纖維素柱層析分離純化得到的各個(gè)級(jí)分對(duì)光照核黃素體系產(chǎn)生的超氧陰離子自由基、Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的羥自由基及DPPH自由基均具有較好的清除作用，并呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。在試驗(yàn)條件下，紅棗多糖對(duì)超氧陰離子自由基、羥自由基及DPPH自由基的清除率分別可達(dá)99.01%、49.46%和36.89%。與原紅棗多糖（ZJP）相比，經(jīng)DE52纖維素柱層析分離純化得到的各個(gè)級(jí)分的自由基清除活性均有一定程度的降低，酸性多糖組分ZJP-1、ZJP-2、ZJP-3較中性多糖ZJP-0表現(xiàn)出更強(qiáng)的自由基清除活性，說(shuō)明紅棗多糖中半乳糖醛酸對(duì)于其自由基清除活性具有重要作用。 適度超聲降解或者鹽酸降解均可提高紅棗多糖對(duì)不同體系產(chǎn)生的自由基的清除能力，但分子量降低至230kDa以下時(shí)其自由基清除活性大幅降低。超聲處理對(duì)紅棗多糖抗氧化活性的影響存在雙重效應(yīng)，既可通過(guò)調(diào)整分子大小影響紅棗多糖抗氧化活性，又可通過(guò)聲場(chǎng)作用造成多糖構(gòu)象改變從而影響紅棗多糖抗氧化活性。在試驗(yàn)條件下，超聲處理最高可使紅棗多糖對(duì)超氧陰離子自由基、羥自由基及DPPH自由基的清除率分別提高3.16、2.00、0.16倍，而鹽酸降解則可使其分別提高4.78、1.46、0.22倍。 不同取代基修飾對(duì)紅棗多糖自由基清除活性產(chǎn)生的效應(yīng)與自由基測(cè)試體系有關(guān)，紅棗多糖清除自由基的效果與其構(gòu)象密切相關(guān)。中等取代度的硫酸酯化紅棗多糖S-ZJP-2（DS=0.79）、S-ZJP-3（DS=1.03）對(duì)超氧陰離子自由基的半抑制劑量（IC50）可較原紅棗多糖（ZJP）降低一半以上，但對(duì)羥自由基和DPPH自由基清除活性的影響較�。霍燃谆揎椏娠@著提高紅棗多糖的羥自由基清除活性，但不利于其超氧陰離子自由基和DPPH自由基清除活性的發(fā)揮；乙�；揎椏纱蠓岣呒t棗多糖的羥自由基清除活性，在試驗(yàn)條件下，五種乙酰化紅棗多糖對(duì)羥自由基的清除效果均較原多糖（ZJP）提高一倍以上，但乙酰化修飾導(dǎo)致紅棗多糖超氧陰離子自由基活性的降低，并改變其清除DPPH自由基的動(dòng)力學(xué)。中等硫酸酯化修飾是提高紅棗多糖超氧陰離子自由基清除活性的最有效方法，而乙酰化修飾和羧甲基化修飾則是提高其羥自由基清除活性的重要手段。 2、降血糖作用 紅棗多糖對(duì)-淀粉酶和-葡萄糖苷酶活性均具有抑制作用，其抑制效果隨著多糖濃度的增加而增大，具有明顯的量效關(guān)系。在試驗(yàn)條件下，紅棗多糖對(duì)α-淀粉酶和-葡萄糖苷酶活性的最高抑制率分別為53.35%和62.65%，IC50分別為11.39mg·mL-1和16.61mg·mL-1。說(shuō)明紅棗多糖可能對(duì)淀粉酶促水解直至生成葡萄糖的整個(gè)過(guò)程的不同階段產(chǎn)生影響，從而可有效延緩單糖的釋放和吸收，抑制餐后高血糖。 與原紅棗多糖（ZJP）相比，除了中性多糖組分ZJP-0的抑制活性略有降低外，，經(jīng)DE52纖維素柱層析分離純化得到的其它三種酸性多糖組分ZJP-1、ZJP-2、ZJP-3對(duì)-淀粉酶的抑制活性均有大幅提高，而四種級(jí)分對(duì)-葡萄糖苷酶的抑制作用和原多糖相比均有不同程度的提高。其中尤以ZJP-1對(duì)-淀粉酶和-葡萄糖苷酶的抑制作用最強(qiáng)，在同濃度條件下可分別較原紅棗多糖（ZJP）提高0.63倍和1.67倍，說(shuō)明ZJP-1在紅棗多糖的-淀粉酶和-葡萄糖苷酶抑制活性中發(fā)揮主要作用。 紅棗多糖經(jīng)超聲降解處理后其對(duì)-淀粉酶的抑制活性減弱，而對(duì)-葡萄糖苷酶活性的抑制作用得到增強(qiáng)，并且抑制效果隨著超聲處理時(shí)間的延長(zhǎng)而提高。低濃度的鹽酸降解可提高紅棗多糖對(duì)-淀粉酶和-葡萄糖苷酶活性的抑制作用，但過(guò)度降解則會(huì)造成抑制活性的降低。紅棗多糖分子量在300~600kDa之間表現(xiàn)出較強(qiáng)的-葡萄糖苷酶抑制活性，但分子量降低至290kDa以下時(shí)其-葡萄糖苷酶抑制活性大幅降低。維持一定的鏈長(zhǎng)和空間構(gòu)象是發(fā)揮其活性的關(guān)鍵。在試驗(yàn)條件下，超聲處理和鹽酸降解最高可使紅棗多糖對(duì)-葡萄糖苷酶活性的抑制率分別提高2.09倍和1.56倍，而鹽酸降解還可使其對(duì)-淀粉酶活性的抑制率提高38.25%。 不同取代基修飾均降低了紅棗多糖對(duì)-淀粉酶的抑制活性，但可增強(qiáng)其對(duì)-葡萄糖苷酶的抑制活性。在試驗(yàn)條件下，硫酸酯化、羧甲基化和乙酰化修飾最高可使紅棗多糖對(duì)-葡萄糖苷酶活性的抑制率分別提高1.87、5.08和3.97倍。羧甲基化修飾是提高紅棗多糖-葡萄糖苷酶抑制活性的最有效方法之一。 3、對(duì)非酶糖化反應(yīng)的抑制作用 紅棗多糖及其經(jīng)DE52纖維素分離純化得到的不同級(jí)分對(duì)BSA-Glu體系非酶糖化反應(yīng)中間產(chǎn)物Amadori和終產(chǎn)物AGEs的形成均具有一定的抑制作用，說(shuō)明紅棗多糖可能對(duì)由非酶糖化反應(yīng)以及由此形成的糖化終產(chǎn)物引起的微血管病變等糖尿病并發(fā)癥具有改善作用。與原紅棗多糖（ZJP）相比，ZJP-0和ZJP-3對(duì)Amadori產(chǎn)物形成的抑制作用增強(qiáng)，而ZJP-1抑制作用略有降低，ZJP-2的抑制作用最弱。而從AGEs形成的情況來(lái)看，則只有ZJP-3的抑制作用高于原多糖，其它組分均較低，說(shuō)明ZJP-3是一種較好的非酶糖化反應(yīng)的抑制劑。 超聲降解和鹽酸降解都可增強(qiáng)紅棗多糖對(duì)非酶糖化反應(yīng)的抑制作用，但抑制效果與降解程度沒(méi)有明顯的相關(guān)性。在試驗(yàn)條件下，超聲降解最高可使紅棗多糖對(duì)Amadori產(chǎn)物和AGEs形成的抑制率分別提高108.93%和29.41%，而鹽酸降解最高可使其分別提高95.55%和29.65%。 取代基修飾可對(duì)紅棗多糖非酶糖化反應(yīng)抑制活性產(chǎn)生較大影響。與未修飾的紅棗多糖相比，低取代度的硫酸酯化紅棗多糖對(duì)Amadori產(chǎn)物和AGEs的形成的抑制作用均得到提高，而高取代度的硫酸酯化紅棗多糖的抑制活性卻大幅下降；而較高取代度的羧甲基化修飾可以顯著增強(qiáng)紅棗多糖對(duì)非酶糖化反應(yīng)的抑制作用，并且抑制活性的增強(qiáng)與羧甲基取代度之間有較好的相關(guān)關(guān)系；各乙酰化紅棗多糖的取代度與其對(duì)非酶糖化反應(yīng)的抑制效果沒(méi)有相關(guān)性。在試驗(yàn)的三種取代基修飾中，以羧甲基化修飾對(duì)紅棗多糖非酶糖化反應(yīng)抑制活性的影響最大，在試驗(yàn)條件下羧甲基取代度最高的CM-ZJP-7對(duì)BSA-Glu非酶糖化反應(yīng)體系中Amadori產(chǎn)物和AGEs的形成的抑制率分別可達(dá)到89.5%和86.3%。因此，羧甲基化修飾可作為提高紅棗多糖非酶糖化反應(yīng)抑制效果的重要手段之一。 4、透明質(zhì)酸酶抑制活性 透明質(zhì)酸的過(guò)度降解可導(dǎo)致關(guān)節(jié)疾病和過(guò)敏及其它類型的炎癥反應(yīng)，而且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。本文研究結(jié)果表明，紅棗多糖對(duì)透明質(zhì)酸酶具有較強(qiáng)的抑制作用，而且隨著紅棗多糖濃度的增加而增強(qiáng)，呈現(xiàn)出較好的量效關(guān)系。因此，紅棗多糖可以阻止體內(nèi)透明質(zhì)酸的分解，有助于維持透明質(zhì)酸的功能，對(duì)于由于透明質(zhì)酸過(guò)度降解造成的各種疾病可能會(huì)具有一定的防治作用。在試驗(yàn)條件下，其對(duì)透明質(zhì)酸酶活性的抑制率最高可達(dá)93.55%，IC50為0.095mg·mL~(-1)。 紅棗多糖經(jīng)DE52纖維素柱層析分離純化得到的各個(gè)級(jí)分對(duì)透明質(zhì)酸酶均有不同程度的抑制作用，其中ZJP-0和ZJP-1對(duì)透明質(zhì)酸酶的抑制活性較原多糖略有提高，而ZJP-2和ZJP-3則較低，說(shuō)明ZJP-0和ZJP-1在紅棗多糖的透明質(zhì)酸酶抑制活性中發(fā)揮主要作用。 紅棗多糖超聲降解至平均分子量在600-660kDa時(shí)透明質(zhì)酸酶抑制活性最強(qiáng)，降至600kDa以下時(shí)即呈下降趨勢(shì)。低濃度鹽酸降解對(duì)紅棗多糖透明質(zhì)酸酶的影響不大，但當(dāng)鹽酸濃度增大至0.4mol/L以上即紅棗多糖平均分子量被降低到200kDa以下時(shí)，其對(duì)透明質(zhì)酸酶的抑制活性急劇降低。這說(shuō)明較高分子量對(duì)于維持紅棗多糖較強(qiáng)的透明質(zhì)酸酶抑制活性十分重要，保持一定的鏈長(zhǎng)是發(fā)揮紅棗多糖對(duì)透明質(zhì)酸酶抑制活性的關(guān)鍵。適度超聲降解有助于提高紅棗多糖的透明質(zhì)酸酶抑制活性。 不同取代基修飾對(duì)紅棗多糖的透明質(zhì)酸酶抑制活性產(chǎn)生的效應(yīng)有較大差別。紅棗多糖經(jīng)不同程度硫酸酯化修飾后對(duì)透明質(zhì)酸酶活性的抑制作用均有不同程度的增強(qiáng)，并且其抑制活性隨硫酸基取代度的增加而增強(qiáng)；而紅棗多糖的乙�；揎梽t使其對(duì)透明質(zhì)酸酶的抑制活性大大降低，且與乙�；〈戎g沒(méi)有相關(guān)性；低取代度羧甲基化修飾使紅棗多糖對(duì)透明質(zhì)酸酶的抑制活性降低，但較高的羧甲基取代會(huì)使紅棗多糖的透明質(zhì)酸酶抑制活性有所提高。在試驗(yàn)條件下，硫酸酯化和羧甲基化修飾最高可使紅棗多糖對(duì)透明質(zhì)酸酶活性的抑制率分別提高45.80%和39.76%。硫酸酯化修飾和高取代度羧甲基化修飾可作為提高紅棗多糖對(duì)透明質(zhì)酸酶抑制活性的重要手段。 綜上所述，分子修飾可通過(guò)多種機(jī)制影響紅棗多糖的生物活性，且與各種活性的不同機(jī)理有關(guān)。通過(guò)分子修飾，一方面可以改善紅棗多糖的溶解性，從而可使其在水溶性測(cè)試系統(tǒng)中發(fā)揮更好的活性。同時(shí)，通過(guò)分子修飾，還可以改變紅棗多糖的空間構(gòu)象，使更多/少的活性基團(tuán)裸露出來(lái)，或形成/破壞紅棗多糖的活性構(gòu)型，造成紅棗多糖活性的改變。不同生物活性產(chǎn)生的機(jī)理和要求的活性基團(tuán)及構(gòu)象特征不同，所以分子修飾產(chǎn)生的效果也存在很大差異。分子修飾導(dǎo)致的紅棗多糖構(gòu)象變化對(duì)于其生物活性的影響較理化性質(zhì)改變更為重要，維持一定的鏈長(zhǎng)和空間構(gòu)象是發(fā)揮其活性的關(guān)鍵。
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【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R151

【引證文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2321418