【摘要】：食品安全與人類健康息息相關(guān),而隨著環(huán)境問題的突出,食品源性鉛暴露屢見不鮮。鉛是一種傳統(tǒng)的重金屬污染物,對神經(jīng)系統(tǒng)尤其是中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有毒性效應(yīng)。本研究組的前期工作結(jié)果表明,發(fā)育期鉛暴露會對大鼠大腦認(rèn)知功能造成一定的損傷,但是其內(nèi)在具體機制尚未完全明確。近來,有研究表明鉛暴露對神經(jīng)元發(fā)育過程有抑制作用,但對其內(nèi)在調(diào)節(jié)機制研究甚少。目的:研究鉛暴露對Sprague-Dawley(SD)大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元增殖、分化的影響及相關(guān)信號通路;研究鉛暴露調(diào)節(jié)神經(jīng)元成熟的詳細生物分子機制進而推測其致神經(jīng)退行性疾病的潛在機制。方法:1.SD大鼠按照雌雄1:3配對后隨機分為正常對照組和鉛暴露組。正常對照組飲用蒸餾水,鉛暴露組飲用鉛水(250ppm醋酸鉛溶于蒸餾水,30mL/d)。實驗鼠自胚胎期開始接受鉛暴露,出生后至斷奶前(出生后21天)通過母乳間接接受鉛暴露,斷奶后通過飲用鉛水直接接受鉛暴露。對照組和鉛暴露組幼鼠均于出生后第19天至21天通過腹腔注射給予5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU),40mg/kg,每天一次,于第22天斷頭取材。免疫組織化學(xué)觀察海馬區(qū)新生神經(jīng)元數(shù)量,Western blot檢測經(jīng)典Wnt通路相關(guān)蛋白表達量,Real-time Quantitative PCR(q-PCR)檢測經(jīng)典Wnt通路中mRNA的表達。2.以離體培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元為實驗材料,從RNA調(diào)控水平深入探究鉛暴露抑制神經(jīng)元發(fā)育的分子機制。取新生大鼠(出生后24小時內(nèi),P0)原代海馬神經(jīng)元進行細胞培養(yǎng),體外培養(yǎng)第3天開始進行醋酸鉛(5μM)處理,連續(xù)暴露11天,于第14天收樣。Western blot實驗和q-PCR實驗分別從蛋白水平和mRNA層面檢測Kmt2a(MLL1)的表達,同時q-PCR實驗檢測具有招募功能的長鏈非編碼RNA(LncRNA)的表達。結(jié)果:1.鉛暴露顯著降低SD大鼠海馬區(qū)新生神經(jīng)元數(shù)目(BrdU標(biāo)記)。2.鉛暴露顯著升高磷酸化β-catenin蛋白水平,降低磷酸化GSK-3β蛋白水平,而對GSK-3β和β-catenin總體蛋白水平?jīng)]有產(chǎn)生顯著影響。此外GSK-3β在mRNA水平上顯著上升。3.鉛暴露顯著抑制MLL1蛋白水平和mRNA水平的表達。4.鉛暴露可影響H3K4me3在染色質(zhì)中分布,并且這種改變可能是通過影響具有招募功能的LncRNA表達實現(xiàn)的。結(jié)論:本研究從經(jīng)典Wnt信號通路和靶分子H3K4me3兩個分子機制作為切入點共同探究發(fā)育期鉛暴露對大腦新生神經(jīng)元的增殖、分化以及成熟兩個方面過程的影響。1.發(fā)育期鉛暴露可能通過抑制經(jīng)典Wnt通路來影響發(fā)育期大鼠海馬區(qū)新生神經(jīng)元增殖、分化。2.對神經(jīng)元發(fā)育成熟過程有重要調(diào)節(jié)作用的MLL1分子的表達受鉛暴露影響,同時改變了H3K4me3在染色質(zhì)上的分布,并且這一過程可能是通過調(diào)控具有招募功能的LncRNA實現(xiàn)的。該研究成果從神經(jīng)元發(fā)育的角度為今后關(guān)于發(fā)育期鉛暴露的神經(jīng)毒性的研究提供了新的視野。
[Abstract]:Food safety is closely related to human health, but with the prominent environmental problems, food-derived lead exposure is common. Lead is a traditional heavy metal pollutant, which has toxic effects on nervous system, especially central nervous system. The preliminary results of this study showed that the brain cognitive function of rats was damaged by lead exposure during developmental period, but its specific mechanism was not completely clear. Recent studies have shown that lead exposure inhibits the development of neurons, but little research has been done on its intrinsic regulatory mechanisms. Objective: to study the effects of lead exposure on the proliferation and differentiation of hippocampal neurons in Sprague-Dawley (SD) rats and the related signal pathways. To study the detailed biomolecular mechanism of lead exposure regulating neuronal maturation and to speculate on the underlying mechanism of neurodegenerative diseases induced by lead exposure. Methods: 1.SD rats were randomly divided into normal control group and lead exposure group. The normal control group drank distilled water, and the lead exposed group drank lead water (250ppm lead acetate dissolved in distilled water, 30mL/d). The mice were exposed to lead from embryonic stage, from birth to before weaning (21 days after birth) through breast milk. After weaning, they were exposed to lead directly by drinking lead water. The young rats in the control group and lead exposure group received intraperitoneal injection of 5-bromodeoxyuridine (BrdU),) 40 mg / kg from 19 to 21 days after birth. Immunohistochemical method was used to detect the number of new neurons in hippocampal area., Western blot was used to detect the expression of classical Wnt pathway associated protein, and Real-time Quantitative PCR (q-PCR) was used to detect the expression of mRNA in classical Wnt pathway. 2. Hippocampal neurons cultured in vitro were used as experimental materials to explore the molecular mechanism of lead exposure inhibiting the development of neurons from the level of RNA regulation. The primary hippocampal neurons of neonatal rats (within 24 hours after birth) were cultured and treated with lead acetate (5 渭 M) on the third day of culture. On the 14th day, the expression of Kmt2a (MLL1) was detected by. Western blot assay and q-PCR assay at the protein level and mRNA level, respectively. Meanwhile, the q-PCR assay was used to detect the expression of long chain non-coding RNA (LncRNA) with recruitment function. The result is 1: 1. Lead exposure significantly decreased the number of neonate neurons (BrdU labeled) in the hippocampus of SD rats. 2. Lead exposure significantly increased the level of phosphorylated 尾-catenin protein, decreased the level of phosphorylated GSK-3 尾-protein, but had no significant effect on the total protein levels of GSK-3 尾 and 尾-catenin. In addition, GSK-3 尾 increased significantly at mRNA level. Lead exposure significantly inhibited the expression of MLL1 protein and mRNA. 4. Lead exposure may affect the distribution of H3K4me3 in chromatin, and this change may be achieved by influencing the expression of LncRNA with recruitment function. Conclusion: in this study, the effects of lead exposure on the proliferation, differentiation and maturation of neonate neurons in the brain were explored from the classical Wnt signaling pathway and the target molecule H3K4me3 as a starting point. 1. Lead exposure during development may affect the proliferation and differentiation of neonatal neurons in the hippocampus of developing rats by inhibiting the classical Wnt pathway. 2. The expression of MLL1 molecules which play an important role in the process of neuronal development and maturation is affected by lead exposure and the distribution of H3K4me3 in chromatin is changed. This process may be achieved by regulating the recruitment of LncRNA. The results provide a new perspective for the study of neurotoxicity of lead exposure in the future from the point of view of neuronal development.
【學(xué)位授予單位】：合肥工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R114

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本文編號：2316078