【摘要】：目的：建立[二-(4-氯苯甲酰異羥肟酸)二正丁基合錫](DBDCT)體內(nèi)與體外的肝毒性模型，采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分別對其作用前后蛋白質(zhì)表達(dá)譜的改變進(jìn)行分析及鑒定，通過對差異蛋白的驗證及其功能分析，推測DBDCT引起肝毒性的主要作用機(jī)制。通過對由差異蛋白Trx1介導(dǎo)的氧化應(yīng)激信號通路的研究，探討DBDCT引起肝毒性的氧化應(yīng)激作用機(jī)制及其毒性靶蛋白。 方法：（1）SD大鼠腹腔注射DBDCT，并記錄動物體重變化及其肝臟系數(shù)，分別檢測血漿肝功生化指標(biāo)，肝組織病理學(xué)變化以及錫的肝臟蓄積，以確定其對大鼠的肝臟毒性。（2）采用2-DE-TOF-TOF-MS分別對正常組和DBDCT染毒組大鼠肝臟膜蛋白和核蛋白表達(dá)譜進(jìn)行分析，鑒定及其驗證。（3）分別采用MTT法，透射電鏡，比色法以及流式細(xì)胞術(shù)檢測DBDCT對HL02肝細(xì)胞的抑制活性，細(xì)胞形態(tài)變化，胞外LDH含量，細(xì)胞凋亡、周期以及胞內(nèi)ROS含量，初步探討DBDCT對HL02細(xì)胞的毒性作用及其機(jī)制。（4）采用2-DE-TOF-TOF-MS對DBDCT處理前后HL02細(xì)胞總蛋白表達(dá)譜進(jìn)行分析，鑒定，并采用比色法、Western blot和RT-PCR方法對差異蛋白的功能及其表達(dá)進(jìn)行驗證。（5）采用Western blot和RT-PCR方法對差異蛋白Trx1，PARK7介導(dǎo)的氧化應(yīng)激通路下游因子ASK1，JNK和P38進(jìn)行檢測；同時采用抗氧化劑乙酰-L-半胱氨酸(NAC)與DBDCT體外共同孵育，檢測細(xì)胞存活率，ROS含量及其上述因子的蛋白變化水平。 結(jié)果：（1）大鼠腹腔注射DBDCT2.3、3.2、4.5mg/kg后，動物體重逐漸增加，且隨著給藥次數(shù)的增加，動物出現(xiàn)不同程度的腹水現(xiàn)象，自發(fā)活動減少，嗜睡，高劑量組部分動物死亡；肝臟系數(shù)隨著給藥濃度的增加逐漸減少；DBDCT中高劑量染毒組AST，AKP和ACP水平明顯升高，而ALT水平隨著給藥劑量的增加逐漸降低；病理切片可見DBDCT中劑量組有散發(fā)肝細(xì)胞嗜酸性變，核固縮，高劑量組被膜增生，部分肝細(xì)胞嗜酸性變，核固縮；原子吸收結(jié)果顯示錫在大鼠肝臟形成一定的蓄積，且呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。（2）采用2-DE-TOF-TOF-MS共分析并鑒定出6個膜蛋白和10個核蛋白，包括甘油醛-3-磷酸脫氫酶(RGD1565368)，磷脂酰乙醇胺凝結(jié)蛋白(Pebp1)，醋酸鹽水解酶1(Iah1)，，S-腺苷甲硫氨酸合酶(Mat1a)，谷氨酸脫氫酶1(Glud1)，翻譯起始因子5A-1(Eif5a)，腺苷酸激酶2(KAD2)，蛋白質(zhì)二硫化物異構(gòu)酶A3(PDIA3)，丁二酸脫氫酶(DHSA)，乙醛脫氫酶(ALDH2)，谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GSTM2)，熱休克蛋白(HS90B)，二甲基甘氨酸脫氫酶(M2GD)，4-羥苯(基)丙酮酸雙(加)氧酶(HPPD)，鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶(OAT)。上述差異蛋白主要參與氧化還原/氧化應(yīng)激，線粒體呼吸鏈電子傳遞，酶代謝以及氨基酸合成等生命過程。（3）體外肝毒性研究結(jié)果顯示DBDCT對HL02細(xì)胞的IC50值為5.77μM，且細(xì)胞固縮變圓，結(jié)構(gòu)模糊，核膜破裂，胞外LDH水平明顯升高。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示DBDCT染毒組細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的凋亡與壞死，G2/M期發(fā)生阻滯，且胞內(nèi)ROS含量逐漸升高。根據(jù)上述結(jié)果初步推測DBDCT的細(xì)胞肝毒性與細(xì)胞凋亡，周期阻滯及其氧化應(yīng)激有關(guān)。（4）通過2-DE-TOF-TOF-MS對DBDCT作用前后HL02肝細(xì)胞總蛋白分析鑒定共得到9個差異蛋白，硫氧還蛋白(Trx1)，核苷酸結(jié)合蛋白(HINT1)，蛋白DJ1(PARK7)，細(xì)胞色素C氧化酶亞型5A(COX5A)，半乳糖凝集素-1(Gal-1)，過氧化物酶2(PRDX2)，過氧化物歧化酶(SODM)，3-羥酰輔酶A脫氫酶2(HCD2)，NADH脫氫酶(NDUS8)，且Western blot和RT-PCR對差異蛋白Trx1和PARK7的驗證結(jié)果與2-DE結(jié)果一致。鑒定的差異蛋白主要參與細(xì)胞的氧化還原/氧化應(yīng)激，線粒體相關(guān)功能，細(xì)胞凋亡、增殖與分化以及微管的調(diào)節(jié)等過程，其中氧化應(yīng)激反應(yīng)占據(jù)重要地位。（5）由Trx1介導(dǎo)的氧化應(yīng)激通路研究顯示DBDCT干預(yù)細(xì)胞后，Trx1、DJ1、ASK1的蛋白表達(dá)和mRNA表達(dá)水平均升高， JNK和P38發(fā)生了蛋白磷酸化修飾，且呈現(xiàn)明顯的時效與量效關(guān)系。N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)與DBDCT共同孵育細(xì)胞后，ROS表達(dá)水平明顯下降，而細(xì)胞存活率上升，Trx1，DJ1蛋白的表達(dá)較DBDCT組降低，且JNK和P38的磷酸化水平也明顯下降。其可能的作用機(jī)制為DBDCT誘導(dǎo)細(xì)胞自由基水平升高，使得Trx1蛋白表達(dá)升高以抵抗氧化應(yīng)激作用，此時的Trx1逐漸失去了與ASK1的結(jié)合能力，使得ASK1游離；同時作為氧化應(yīng)激的伴侶蛋白，DJ1也被激活并與死亡蛋白Daxx結(jié)合，進(jìn)而抑制Daxx與ASK1的結(jié)合，使得游離的ASK1表達(dá)升高，激活MAPK通路中的JNK和P38，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡與壞死。結(jié)論：（1）體內(nèi)外研究證明，DBDCT可引起明顯的肝毒性。（2）氧化應(yīng)激反應(yīng)在毒性作用中占據(jù)重要地位，且主要通過升高胞內(nèi)自由基水平，激活由Trx1介導(dǎo)的氧化應(yīng)激通路來實現(xiàn)的。（3）抗氧化劑NAC可通過降低胞內(nèi)ROS水平，進(jìn)而影響Trx1介導(dǎo)的氧化應(yīng)激通路以抵抗DBDCT引起的肝毒性。（4）Trx1蛋白可作為DBDCT引發(fā)肝毒性的早期監(jiān)測指標(biāo)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R114

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2270085