【摘要】：目的：建立[二-(4-氯苯甲酰異羥肟酸)二正丁基合錫](DBDCT)體內與體外的肝毒性模型，采用蛋白質組學技術分別對其作用前后蛋白質表達譜的改變進行分析及鑒定，通過對差異蛋白的驗證及其功能分析，推測DBDCT引起肝毒性的主要作用機制。通過對由差異蛋白Trx1介導的氧化應激信號通路的研究，探討DBDCT引起肝毒性的氧化應激作用機制及其毒性靶蛋白。 方法：（1）SD大鼠腹腔注射DBDCT，并記錄動物體重變化及其肝臟系數，分別檢測血漿肝功生化指標，肝組織病理學變化以及錫的肝臟蓄積，以確定其對大鼠的肝臟毒性。（2）采用2-DE-TOF-TOF-MS分別對正常組和DBDCT染毒組大鼠肝臟膜蛋白和核蛋白表達譜進行分析，鑒定及其驗證。（3）分別采用MTT法，透射電鏡，比色法以及流式細胞術檢測DBDCT對HL02肝細胞的抑制活性，細胞形態(tài)變化，胞外LDH含量，細胞凋亡、周期以及胞內ROS含量，初步探討DBDCT對HL02細胞的毒性作用及其機制。（4）采用2-DE-TOF-TOF-MS對DBDCT處理前后HL02細胞總蛋白表達譜進行分析，鑒定，并采用比色法、Western blot和RT-PCR方法對差異蛋白的功能及其表達進行驗證。（5）采用Western blot和RT-PCR方法對差異蛋白Trx1，PARK7介導的氧化應激通路下游因子ASK1，JNK和P38進行檢測；同時采用抗氧化劑乙酰-L-半胱氨酸(NAC)與DBDCT體外共同孵育，檢測細胞存活率，ROS含量及其上述因子的蛋白變化水平。 結果：（1）大鼠腹腔注射DBDCT2.3、3.2、4.5mg/kg后，動物體重逐漸增加，且隨著給藥次數的增加，動物出現(xiàn)不同程度的腹水現(xiàn)象，自發(fā)活動減少，嗜睡，高劑量組部分動物死亡；肝臟系數隨著給藥濃度的增加逐漸減少；DBDCT中高劑量染毒組AST，AKP和ACP水平明顯升高，而ALT水平隨著給藥劑量的增加逐漸降低；病理切片可見DBDCT中劑量組有散發(fā)肝細胞嗜酸性變，核固縮，高劑量組被膜增生，部分肝細胞嗜酸性變，核固縮；原子吸收結果顯示錫在大鼠肝臟形成一定的蓄積，且呈現(xiàn)明顯的量效關系。（2）采用2-DE-TOF-TOF-MS共分析并鑒定出6個膜蛋白和10個核蛋白，包括甘油醛-3-磷酸脫氫酶(RGD1565368)，磷脂酰乙醇胺凝結蛋白(Pebp1)，醋酸鹽水解酶1(Iah1)，，S-腺苷甲硫氨酸合酶(Mat1a)，谷氨酸脫氫酶1(Glud1)，翻譯起始因子5A-1(Eif5a)，腺苷酸激酶2(KAD2)，蛋白質二硫化物異構酶A3(PDIA3)，丁二酸脫氫酶(DHSA)，乙醛脫氫酶(ALDH2)，谷胱甘肽S-轉移酶(GSTM2)，熱休克蛋白(HS90B)，二甲基甘氨酸脫氫酶(M2GD)，4-羥苯(基)丙酮酸雙(加)氧酶(HPPD)，鳥氨酸轉氨酶(OAT)。上述差異蛋白主要參與氧化還原/氧化應激，線粒體呼吸鏈電子傳遞，酶代謝以及氨基酸合成等生命過程。（3）體外肝毒性研究結果顯示DBDCT對HL02細胞的IC50值為5.77μM，且細胞固縮變圓，結構模糊，核膜破裂，胞外LDH水平明顯升高。流式細胞術檢測結果顯示DBDCT染毒組細胞出現(xiàn)不同程度的凋亡與壞死，G2/M期發(fā)生阻滯，且胞內ROS含量逐漸升高。根據上述結果初步推測DBDCT的細胞肝毒性與細胞凋亡，周期阻滯及其氧化應激有關。（4）通過2-DE-TOF-TOF-MS對DBDCT作用前后HL02肝細胞總蛋白分析鑒定共得到9個差異蛋白，硫氧還蛋白(Trx1)，核苷酸結合蛋白(HINT1)，蛋白DJ1(PARK7)，細胞色素C氧化酶亞型5A(COX5A)，半乳糖凝集素-1(Gal-1)，過氧化物酶2(PRDX2)，過氧化物歧化酶(SODM)，3-羥酰輔酶A脫氫酶2(HCD2)，NADH脫氫酶(NDUS8)，且Western blot和RT-PCR對差異蛋白Trx1和PARK7的驗證結果與2-DE結果一致。鑒定的差異蛋白主要參與細胞的氧化還原/氧化應激，線粒體相關功能，細胞凋亡、增殖與分化以及微管的調節(jié)等過程，其中氧化應激反應占據重要地位。（5）由Trx1介導的氧化應激通路研究顯示DBDCT干預細胞后，Trx1、DJ1、ASK1的蛋白表達和mRNA表達水平均升高， JNK和P38發(fā)生了蛋白磷酸化修飾，且呈現(xiàn)明顯的時效與量效關系。N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)與DBDCT共同孵育細胞后，ROS表達水平明顯下降，而細胞存活率上升，Trx1，DJ1蛋白的表達較DBDCT組降低，且JNK和P38的磷酸化水平也明顯下降。其可能的作用機制為DBDCT誘導細胞自由基水平升高，使得Trx1蛋白表達升高以抵抗氧化應激作用，此時的Trx1逐漸失去了與ASK1的結合能力，使得ASK1游離；同時作為氧化應激的伴侶蛋白，DJ1也被激活并與死亡蛋白Daxx結合，進而抑制Daxx與ASK1的結合，使得游離的ASK1表達升高，激活MAPK通路中的JNK和P38，最終導致細胞凋亡與壞死。結論：（1）體內外研究證明，DBDCT可引起明顯的肝毒性。（2）氧化應激反應在毒性作用中占據重要地位，且主要通過升高胞內自由基水平，激活由Trx1介導的氧化應激通路來實現(xiàn)的。（3）抗氧化劑NAC可通過降低胞內ROS水平，進而影響Trx1介導的氧化應激通路以抵抗DBDCT引起的肝毒性。（4）Trx1蛋白可作為DBDCT引發(fā)肝毒性的早期監(jiān)測指標。
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【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R114

【參考文獻】

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本文編號：2270085