【摘要】：咖啡因具有幾千年的使用歷史,是世界范圍內(nèi)最普遍消費(fèi)的活性食物成分。關(guān)于咖啡因廣泛食用而產(chǎn)生的厭食作用,從而幫助人們維持或降低體重這一觀點(diǎn)一直存在爭議。而且目前對于咖啡因引起的厭食作用研究僅僅是從動物及人類對食物的認(rèn)知及動機(jī)出發(fā),對于其具體的機(jī)制尚不清楚。味覺是動物攝食行為的主要調(diào)節(jié)及驅(qū)動因子,咖啡因暴露后引起的厭食作用是否來自于味覺基礎(chǔ)的變化尚未見報道。所以本研究結(jié)合近年來味覺感受機(jī)制、味覺感受影響因素和味覺可塑性等研究成果,提出了咖啡因長期暴露改變攝食行為以味覺外周感受器味蕾的變化為基礎(chǔ)的假設(shè)。以ICR小鼠為動物模型,采用動物行為學(xué)、免疫組織化學(xué)、Western blot、實(shí)時熒光PCR及ELISA等多種方法相結(jié)合,探究了咖啡因長期暴露不同年齡段小鼠味覺行為改變與外周感受器即味蕾特征性變化(包括味蕾及味蕾細(xì)胞形態(tài)變化、味覺感受相關(guān)蛋白表達(dá)量變化)之間的相關(guān)性；同時延伸了咖啡因長期暴露作用,探討了咖啡因長期暴露對小腸絨毛形態(tài)、甜味感受相關(guān)蛋白表達(dá)及腸道內(nèi)葡萄糖吸收的影響；并且通過不同咖啡因刺激方式探討了食物口腔感受及食物攝入后作用在味覺感受變化中的貢獻(xiàn)。實(shí)驗結(jié)果從多角度揭示了外周味覺感受器變化與咖啡因引起厭食作用的相關(guān)性,為咖啡因長期作用引起的厭食作用提供了味覺感受基礎(chǔ)方面的理論依據(jù)。主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下： (1)咖啡因長期暴露改變小鼠味覺偏好 不同年齡段正常組小鼠對咖啡因表現(xiàn)出不同的偏好模式,P24小鼠表現(xiàn)為典型的“冷漠-回避”模式,回避閾值為5.17 mmol/L;而P32及P49小鼠表現(xiàn)為典型的“冷漠-偏好-回避”,偏好閾值分別為0.92mmol/L和0.09 mmol/L,回避閾值分別為5.17 mmol/L和16.28mmol/L。與對照組小鼠性比,咖啡因暴露對不同年齡段小鼠咖啡因味覺偏好模式無影響,但增強(qiáng)各年齡段小鼠耐受性。青春前期及青春期小鼠表現(xiàn)為偏好率的增加,而青春期及成年小鼠還表現(xiàn)為偏好閾值的升高,偏好閾值分別為5.17 mmol/L和0.29 mmol/L。各個年齡段對照組及咖啡因暴露組小鼠具有相同的AK糖偏模式及最佳偏好濃度,表現(xiàn)為典型的“冷漠-偏好-回避”模式。但咖啡因長期暴露改變小鼠AK糖偏好閾值及偏好率,此作用具有刺激起始年齡差異性。與對照組小鼠相比,咖啡因暴露后降低青春前期小鼠AK偏好閾值,分別為1.33 mmol/L和0.42 mmol/L;而青春期及成年期刺激組小鼠表現(xiàn)為偏好閾值升高,均為0.42 mmol/L/1.33 mmol/L,偏好率降低,分別降低約6%和13.83%�？傊鲜鼋Y(jié)果表明不同年齡段小鼠咖啡因味覺偏好模式不同,為其他以咖啡因為研究對象的行為學(xué)研究提供了實(shí)驗依據(jù)；其次本研究證明了咖啡因長期暴露后小鼠甜味偏好降低,為以小鼠為模型的咖啡因長期暴露引起可口食物厭膩感作用研究提供了行為學(xué)依據(jù)。 (2)咖啡因長期暴露改變小鼠菌狀味蕾解剖形態(tài)特征 咖啡因長期暴露對舌面味蕾總數(shù)的影響無咖啡因暴露劑量差異性,除青春期500 mg/L對照組小鼠外,長期咖啡因暴露不改變小鼠舌面菌狀味蕾總數(shù),單個舌面味蕾數(shù)量基本位于100-110個之間�？Х纫蜷L期暴露后各年齡段小鼠菌狀味蕾最大橫截面積雖無顯著變化,橫截面積基本位于1500-1600μm2之間,但與對照組小鼠相比,青春期及成年咖啡因刺激組小鼠菌狀味蕾最大橫截面呈明顯減少趨勢；同時味蕾縱軸高度也因咖啡因暴露而顯著降低,與對照組小鼠相比,青春前期、青春期及成年激組小鼠味蕾高度分別降低13%/11%、13%/13%、13%/13%(300 mg/L/500 mg/L刺激組)；而且咖啡因長期暴露后單個味蕾中細(xì)胞總數(shù)也呈減少趨勢,尤其是青春期及成年小鼠味蕾細(xì)胞總數(shù)顯著減少,與對照組相比分別減少20%/14%、15%/8%(300mg/L/500 mg/L刺激組),而且具有顯著的咖啡因暴露劑量差異性。綜上所述咖啡因長期暴露通過減少味蕾最大橫截面積、味蕾縱軸高度及單個味蕾中味細(xì)胞總數(shù),綜合減小味蕾體積,而且這種作用具有刺激起始年齡差異性,與青春前期小鼠相比,青春期及成年小鼠受咖啡因影響更大。而味蕾體積及味蕾細(xì)胞數(shù)量的減少可能導(dǎo)致味覺傳入信息及味覺感受神經(jīng)激活的降低,從而影響動物的飲食行為。 (3)咖啡因長期暴露改變菌狀味蕾甜味感受相關(guān)蛋白表達(dá) 免疫熒光定量結(jié)果表明,長期咖啡因暴露顯著降低所有年齡段小鼠單個菌狀味蕾中α-gustducin陽性味細(xì)胞數(shù),與對照組小鼠相比,500 mg/L咖啡因長期暴露后P24、P32及P49天雄性小鼠單個味蕾中α-gustducin陽性味蕾細(xì)胞數(shù)分別分別減少約22%、15%和23%,平均減少20%；與雌性小鼠相比,雄性小鼠受咖啡因影響程度更大(P0.05),雌性P24/P32/P49天刺激組小鼠單個味蕾陽性味蕾細(xì)胞數(shù)分別減少15%、9%和16%,平均減少約13%,所以后期實(shí)驗均采用雄性ICR小鼠為實(shí)驗對象。與對照組小鼠相比,300 mg/L雄性P24/P32/P49天刺激組小鼠單個味蕾中α-gustducin陽性味細(xì)胞數(shù)分別減少約29%、33%和37%,平均減少33%,下降率顯著高于500 mg/L刺激組小鼠(P0.05),所以后期實(shí)驗中均采用300 mg/L咖啡因暴露濃度。而且上述300 mg/L咖啡因長期暴露對α-gustducin表達(dá)影響通過Western Blot結(jié)果得到進(jìn)一步證實(shí),與對照組小鼠相比,P24,P32,P49三個年齡咖啡因刺激小鼠α-gustducin蛋白表達(dá)豐度分別降低約1.43、1.29和1.28倍。同時利用Western Blot技術(shù)對PLCP2、甜味受體T1R2/T1R3及SNAP25的表達(dá)豐度分析表明,與對照組小鼠相比,P24/P32/P49天咖啡因刺激組小鼠PLC(32也呈下調(diào)趨勢,分別下調(diào)約1.35、1.41和1.08倍；但甜味受體蛋白T1R2/T1R3表達(dá)豐度呈上調(diào)趨勢,分別上調(diào)3.28/2.18、3.29/1.94和2.55/2.05倍；而對SNAP25表達(dá)基本無影響。而且通過比較四種不同刺激物(咖啡因、奎寧、AK及蔗糖)長期暴露對小鼠味覺感受蛋白表達(dá)影響結(jié)果發(fā)現(xiàn),咖啡因?qū)Ω鞣N味覺感受蛋白表達(dá)的影響具有特異性�？傊Х纫蜷L期暴露影響味覺信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白a-gustducin(減少)、PLCβ2(減少)、甜味受體蛋白T1R2/T1R3(增加)表達(dá)。而且這些影響具有性別及暴露劑量差異性,雄性受影響程度更大,低劑量咖啡因暴露作用更大。 綜合以上三部分實(shí)驗結(jié)果表明咖啡因長期暴露改變不同年齡段小鼠外周味覺感受器-味蕾解剖形態(tài)(包括減少味蕾最大橫截面及縱軸高度,單個味蕾中味細(xì)胞總數(shù)),同時伴隨有味覺感受相關(guān)蛋白α-gustducin、PLCβ2表達(dá)豐度降低,甜味受體蛋白T1R2/T1R3表達(dá)豐度增加,而這些結(jié)構(gòu)與功能的變化可能是咖啡因長期暴露降低甜味偏好的味覺基礎(chǔ)。 (4)咖啡因長期暴露改變小腸不同區(qū)域甜味感受相關(guān)蛋白表達(dá)及腸道內(nèi)葡萄糖耐受性 長期咖啡因暴露顯著增加小鼠小腸各部分絨毛高度,與對照組小鼠相比,刺激組小鼠十二指腸、中間段空腸及回腸小腸絨毛高度分別增長約8%、6%及3%；而對隱窩深度的影響恰好相反,刺激組小鼠十二指腸、中間段空腸及回腸隱窩的深度分別減少約7%、3%及7%。綜合以上結(jié)果,咖啡因暴露組小鼠各段小腸絨毛絨腺比顯著增加,分別增加約9%、9%和10%。免疫共定位結(jié)果表明α-gustducin與甜味受體蛋白T1R2/T1R3存在小腸各個部分,而且彼此存在共表達(dá)。而Western Blot對上述蛋白表達(dá)進(jìn)行定量分析表明,與對照組小鼠相比,十二指腸、空腸及回腸中甜味受體蛋白T1R2/T1R3表達(dá)豐度均顯著呈增加趨勢,分別上調(diào)2.38/1.74倍、1.61/2.17倍和1.71/2.30倍；而α-gustducin表達(dá)豐度在十二指腸中呈下降趨勢,空腸及回腸中無顯著變化；咖啡因長期暴露基本不改變下SNAP25在各段小腸中表達(dá)。根據(jù)甜味受體及α-gustducin在腸道甜味感受、餐后GLP-1等其他腸道激素分泌調(diào)節(jié)的中作用及我們的研究結(jié)果,對禁食葡萄糖灌胃后血漿中GLP-1及胰島素釋放及葡萄糖耐受性進(jìn)行分析,結(jié)果表明與對照組小鼠相比,咖啡因刺激小鼠對葡萄糖存在更高的GLP-1及胰島素分泌,同時受到咖啡因長期暴露的影響,刺激組小鼠葡萄糖耐受性顯著增強(qiáng)。綜上所述咖啡因長期暴露顯著增加小腸絨毛高度,上調(diào)小鼠各部分小腸甜味受體蛋白T1R2/T1R3表達(dá)豐度,改變腸道內(nèi)甜味感受生物學(xué)基礎(chǔ)；另外咖啡因長期暴露增強(qiáng)GLP-1及胰島素對腸道內(nèi)葡萄糖存在的響應(yīng),同時也改變了腸道內(nèi)葡萄糖動態(tài)平衡；但是關(guān)于這些改變的相關(guān)性還有待于進(jìn)一步實(shí)驗的深入探究。 (5)咖啡因口后攝入作用對口腔味覺感受器特征改變的貢獻(xiàn) 利用口后灌胃與口腔自由飲用咖啡因溶液方式分析咖啡因攝入后作用對味覺外周感受器味蕾特征改變貢獻(xiàn)的結(jié)果表明,兩種激方式均改變菌狀味蕾特征性,包括味蕾縱軸高度降低、單個味蕾中味細(xì)胞數(shù)量及α-gustducin陽性細(xì)胞數(shù)減少,α-gustducin表達(dá)豐度降低,甜味受體蛋白T1R2/T1R3表達(dá)豐度增加,但咖啡因口后灌胃作用小于口腔自由飲用咖啡因溶液暴露方式。表明咖啡因攝入后作用,對于味覺外周感受器味蕾特征性改變可能具有重要貢獻(xiàn)作用。
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【學(xué)位授予單位】：浙江工商大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R151

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 劉斯斯;陳夢玲;張根華;;咖啡因與味覺感知[J];常熟理工學(xué)院學(xué)報;2011年02期

2 胡玲玲;施鵬;;苦味受體基因家族功能和演化研究的最新進(jìn)展[J];科學(xué)通報;2009年17期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 張根華;甜味偏好可塑性的味覺細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)[D];浙江工商大學(xué);2007年

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本文編號：2262242