【摘要】：第一部分：急性、亞慢性鋁暴露對大鼠海馬LTP損害作用及對AMPA受體外化的影響 從本課題組的前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在亞慢性染鋁致大鼠學(xué)習(xí)記憶損害的動物模型中，海馬細(xì)胞內(nèi)AMPA受體亞單位的表達(dá)量降低，說明AMPA受體與鋁損害學(xué)習(xí)記憶的機(jī)制有關(guān)。同時AMPA受體作為LTP的主要表達(dá)機(jī)制，我們有理由認(rèn)為AMPA受體可能是鋁損害LTP機(jī)制之一。所以，本項(xiàng)目擬通過急性和亞慢性鋁暴露，觀察不同劑量鋁對大鼠海馬LTP的影響，以及在損害LTP的情況下，AMPA受體外化（AMPA受體亞基GluR1、GluR2分別在胞膜和總蛋白中蛋白表達(dá)量）的改變，為闡明鋁損害LTP的機(jī)制研究提供有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 第一章急性鋁暴露對大鼠海馬LTP的影響 目的：探討急性鋁暴露對大鼠海馬LTP的影響。方法：對照組、低、中、高染鋁組大鼠通過側(cè)腦室給藥的方式分別一次性接受生理鹽水、2.43μg Al(mal)3、12.15μg Al(mal)3和60.75μug Al(mal)3，給藥容積為5μl，5min內(nèi)緩慢勻速注入。采用在體海馬CA1區(qū)LTP及PPF記錄技術(shù)，記錄fEPSP。結(jié)果：各個劑量組在給藥前和給藥后5min、15min、30min的fEPSP幅度變化不大，無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)；側(cè)腦室內(nèi)注射生理鹽水及不同劑量Al(mal)3后不影響PPF，與注射前相比沒有顯著性差異(P0.05)， Al(mal)3未對突觸前釋放產(chǎn)生影響；對照組在高頻刺激后fEPSP即刻增大至（221±10）%，1h后仍保持在（190±27）%，但注射了Al(mal)3的中高劑量組在在高頻刺激后fEPSP即刻增大的幅度僅為（165±21）%和（149±8）%，在1h之后，中劑量組fEPSP幅度僅保持在（140±13）%，高劑量組fEPSP幅度幾乎回到了高頻刺激前的基礎(chǔ)水平（110±7）%，與對照組組比顯著降低（P0.05），低劑量組雖然在高頻刺激后fEPSP即刻增大的幅度達(dá)到了（194±19）%，與對照組無差別(P0.05)，但在30min及1h后，幅度降低到了（164±13）%和（157±8）%，比對照組明顯降低，由此可見，Al(mal)3對LTP的誘導(dǎo)與維持的抑制成明顯的劑量依賴性。結(jié)論： Al(mal)3對LTP的誘導(dǎo)與維持的有明顯的抑制作用，并呈現(xiàn)出顯著的劑量依賴性，這可能與鋁損害突觸后機(jī)制（如，NMDAR、AMPAR等谷氨酸受體）有關(guān)。 第二章急性鋁暴露對大鼠海馬AMPA受體外化的影響 目的：探討急性鋁暴露對海馬AMPA受體外化的影響。方法：對照組、低、中、高染鋁組大鼠通過側(cè)腦室給藥的方式分別一次性接受生理鹽水、2.43μg Al(mal)3、12.15μgAl(mal)3和60.75ug Al(mal)3，給藥容積為5μl，5min內(nèi)緩慢勻速注入。在電生理實(shí)驗(yàn)結(jié)束后斷頭取海馬，分別提取總蛋白和膜蛋白，采用Western-blot的方法檢測AMPA受體亞單位GluR-1、GluR-2的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：總蛋白中，低、中、高染鋁組上述兩種亞單位的蛋白表達(dá)量無變化，且與對照組相比，無統(tǒng)計學(xué)差異（P0.05）；膜蛋白中，低、中、高染鋁組上述兩種亞單位的蛋白表達(dá)量呈逐下降的趨勢，且與對照組相比，有統(tǒng)計學(xué)差異（P0.05）。結(jié)論：急性鋁暴露未影響AMPA受體的蛋白合成，但抑制了AMPA受體從胞漿向胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)（外化）。 第三章亞慢性鋁暴露對大鼠海馬LTP的影響 目的：探討亞慢性鋁暴露對大鼠海馬LTP的影響。方法：健康成年雄性SD大鼠24只，按體重隨機(jī)分為4組：生理鹽水、低劑量組Al(mal)3（0.41mg/kg）、中劑量組Al(mal)3（0.82mg/kg）與高劑量組Al(mal)3（1.23mg/kg），腹腔注射染毒8周后，采用在體海馬CA1區(qū)LTP記錄技術(shù)，記錄fEPSP。結(jié)果：對照組在高頻刺激后fEPSP即刻增大至（191±9）%，30min時保持在（154±15）%，60min后降低到（139±12）%；低劑量組fEPSP幅度在高頻刺激后1min、30min、60min時的幅度分別為（195±17）%、（153±21）%和（131±18）%，與對照組比較，無統(tǒng)計學(xué)差異（P0.05）；中劑量組fEPSP幅度在高頻刺激后1min、30min、60min時的幅度分別為（176±21）%、（132±20）%和（117±7）%，與對照組比較，30min、60min時的幅度有統(tǒng)計學(xué)差異（P 0.05），與低劑量組比較30min時的幅度有統(tǒng)計學(xué)差異（P0.05）；高劑量組fEPSP幅度在高頻刺激后1min、30min、60min時的幅度分別為（175±40）%、（106±5）%和（85±10）%，與對照組比較，30min、60min時的幅度有統(tǒng)計學(xué)差異（P0.05），與低劑量組比較30min、60min時的幅度有統(tǒng)計學(xué)差異（P0.05），與中劑量組比較30min、60min時的幅度有統(tǒng)計學(xué)差異（P0.05）。結(jié)論：亞慢性鋁暴露對大鼠海馬CA1區(qū)LTP呈顯著的抑制作用，并成一定的劑量依賴性。 第四章亞慢性鋁暴露對大鼠海馬AMPA受體蛋白外化的影響 目的：探討亞慢性鋁暴露對海馬AMPA受體外化的影響。方法：健康成年雄性SD大鼠24只，按體重隨機(jī)分為4組：生理鹽水、低劑量組Al(mal)3（0.41mg/kg）、中劑量組Al(mal)3（0.82mg/kg）與高劑量組Al(mal)3（1.23mg/kg），腹腔注射染毒8周，在電生理實(shí)驗(yàn)結(jié)束后斷頭取海馬，分別提取總蛋白和膜蛋白，采用Western-blot的方法檢測AMPA受體亞單位GluR-1、GluR-2的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：總蛋白中，高劑量組GluR-1蛋白表達(dá)量且與對照組相比，顯著降低（P 0.05），中、高劑量組的GluR-2蛋白表達(dá)量與對照組比較明顯降低（P0.05），且高劑量組的GluR-2蛋白表達(dá)量與低劑量組相比降低明顯（P 0.05）；膜蛋白中，兩種亞單位的蛋白表達(dá)量隨著染毒劑量的增加呈逐漸下降的趨勢，中、高劑量組GluR-1、 GluR-2蛋白表達(dá)量且與其對照組相比，顯著降低（P0.05），且高劑量組的GluR-1蛋白表達(dá)量與低劑量組相比降低明顯（P0.05）。結(jié)論：亞慢性鋁暴露不但抑制了AMPA受體從胞漿向胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)（外化），而且也抑制了AMPA受體的合成。 第二部分鋁損害AMPA受體外化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制研究 從本文第一部分的研究結(jié)果來看，AMPA受體參與鋁損害大鼠海馬LTP的發(fā)生機(jī)制，而其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制還不清楚。本部分研究擬采用在體電生理技術(shù)、western-blot和ELISA方法觀察在急性鋁暴露的情況下，伴隨LTP損害情況下，RAS、MAPK、PI3K通路各個信號分子的表達(dá)情況，以及使用RAS活化劑的情況下，LTP及各個信號分子的變化。通過此次研究初步闡明AMPA受體外化在鋁損害大鼠海馬LTP中的作用及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，為鋁致學(xué)習(xí)記憶損傷的機(jī)制研究及未來的干預(yù)研究提供有力的依據(jù)。 第一章RAS在鋁致大鼠LTP損害過程中的作用研究 第一節(jié)急性鋁暴露對大鼠海馬RAS活性的影響 目的：探討急性鋁暴露對大鼠海馬RAS蛋白活性的影響。方法：對照組、低、中、高染鋁組大鼠通過側(cè)腦室給藥的方式分別一次性接受生理鹽水、2.43μg Al(mal)3、12.15μgAl(mal)3和60.75μg Al(mal)3，給藥容積為5μl，5min內(nèi)緩慢勻速注入。在電生理實(shí)驗(yàn)LTP測定結(jié)束后，斷頭取海馬提蛋白，采用ELISA法測定RAS蛋白活性。結(jié)果：隨著染鋁劑量的增加，RAS活性呈逐漸下降的趨勢，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，與對照組比較，中、高劑量組的RAS活性顯著下降（P0.05）。結(jié)論：急性鋁暴露會抑制RAS蛋白的活性，RAS活性的降低可能與鋁損害LTP有密切關(guān)系。 第二節(jié)RAS活化劑EGF在鋁致大鼠LTP損害中的拮抗作用研究 目的：探討RAS活化劑EGF在鋁致大鼠LTP損害的拮抗作用。方法：健康成年雄性SD大鼠24只，按體重隨機(jī)分為4組：對照組（生理鹽水）、EGF組.、Al+EGF組與Al組。采用側(cè)腦室注射的方式一次性給予對照組大鼠5μl生理鹽水，給予EGF組大鼠60ngEGF，給予Al+EGF組大鼠12.15μgAl和60ngEGF，給予Al組大鼠12.15μgAl。采用在體海馬CA1區(qū)LTP記錄技術(shù)，記錄fEPSP。在電生理實(shí)驗(yàn)LTP測定結(jié)束后，斷頭取海馬提蛋白，采用ELISA法測定RAS蛋白活性。結(jié)果：高頻刺激后，對照組fEPSP幅度立即升高到（191±25）%，30min時保持在（179±22）%，60min后仍能保持在（156±27）%，而單純?nèi)句X組fEPSP幅度在1min時為（160±4）%，在30min時持續(xù)下降到（132±15）%，而到60min時已完全恢復(fù)致基線水平（115±12）%，說明12.15ugAl顯著的抑制了LTP的誘導(dǎo)和維持，這與我們第一部分第一章的結(jié)果相一致。EGF作為RAS的活化劑，我們在觀察它是否會拮抗Al對LTP的抑制作用之前，我們首先觀察了單獨(dú)使用EGF是否會引起LTP的變化。結(jié)果顯示，60ngEGF組高頻刺激后fEPSP幅度在1min、20min時分別是（224±28）%和（189±14）%，與對照組比較幅度升高很明顯（P0.05），，但到了30min、40min、60min時，fEPSP幅度與對照組一致，無明顯差別（P0.05）。此結(jié)果顯示，EGF可以增強(qiáng)早期的LTP誘導(dǎo)，但到了后期作用減弱。最后我們聯(lián)合使用了12.15ugAl和60ng EGF，結(jié)果我們驚喜的發(fā)現(xiàn)，EGF可以拮抗Al導(dǎo)致的LTP損害，在高頻刺激后的1min、20min時，12.15ug Al+60ng EGF組fEPSP幅度分別為（183±5）%和（158±15）%，與單獨(dú)使用12.15ugAl組比較，有了明顯的上升（P 0.05），但到了30min、40min、60min時，fEPSP幅度與12.15ugAl組一致，無明顯差別（P0.05）。此結(jié)果說明EGF可以拮抗Al對LTP誘導(dǎo)的早期損害，但到了后期，這種拮抗作用減弱。結(jié)論：RAS活化劑的EGF可以拮抗急性鋁暴露致LTP早期損害作用，急性鋁暴露致大鼠海馬LTP損害與RAS蛋白活性降低有關(guān)。 第二章PI3K/PKB通路在鋁致大鼠LTP損害過程中的作用研究 目的：探討PI3K/PKB通路在鋁致大鼠LTP損害過程中的作用。方法：健康成年雄性SD大鼠24只，按體重隨機(jī)分為4組：對照組（生理鹽水）、EGF組.、Al+EGF組與Al組。采用側(cè)腦室注射的方式一次性給予對照組大鼠5μl生理鹽水，給予EGF組大鼠60ngEGF，給予Al+EGF組大鼠12.15μgAl和60ngEGF，給予Al組大鼠12.15ugAl。在電生理實(shí)驗(yàn)LTP測定結(jié)束后，斷頭取海馬提蛋白，采用ELISA法測定PKB蛋白活性，采用western-blot法測定GluR1S831和S845位點(diǎn)磷酸化水平。結(jié)果：與對照組比較，單獨(dú)給予12.15μg Al后，PKB活性明顯下降（P 0.05），單獨(dú)給予60ng EGF后，PKB活性明顯升高（P 0.05），當(dāng)聯(lián)合給予12.15μgAl和60ng EGF后，與單獨(dú)染鋁組相比，PKB活性又有明顯的回升（P0.05）；與對照組比較，單獨(dú)給予12.15μg Al后，GluR1S831和S845位點(diǎn)磷酸化水平明顯下降（P 0.05），單獨(dú)給予60ng EGF后，其磷酸化水平明顯升高（P 0.05），當(dāng)聯(lián)合給予12.15μgAl和60ng EGF后，與單獨(dú)染鋁組相比，其磷酸化水平又有明顯的回升（P 0.05）。結(jié)論：鋁可能通過RAS-PI3K信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路致AMPA受體磷酸化障礙，進(jìn)而影響AMPA受體外化，最終表現(xiàn)出LTP的誘導(dǎo)受到抑制。 第三章MAPK/ERK通路在鋁致大鼠LTP損害過程中的作用研究 目的：探討MAPK/ERK通路在鋁致大鼠LTP損害過程中的作用。方法：健康成年雄性SD大鼠24只，按體重隨機(jī)分為4組：對照組（生理鹽水）、EGF組.、Al+EGF組與Al組。采用側(cè)腦室注射的方式一次性給予對照組大鼠5ul生理鹽水，給予EGF組大鼠60ngEGF，給予Al+EGF組大鼠12.15μgAl和60ngEGF，給予Al組大鼠12.15μgAl。在電生理實(shí)驗(yàn)LTP測定結(jié)束后，斷頭取海馬提蛋白，采用ELISA法測定ERK蛋白活性。結(jié)果：與對照組比較，單獨(dú)給予12.15μgAl后，ERK活性明顯下降（P 0.05），單獨(dú)給予60ng EGF后，ERK活性明顯升高（P 0.05），當(dāng)聯(lián)合給予12.15μgAl和60ng EGF后，與單獨(dú)染鋁組相比，ERK活性又有明顯的回升（P 0.05）。結(jié)論：鋁可抑制RAS-MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。但由于未檢測GluR2L S841的磷酸化水平，所以還不能確定RAS-MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是否可致AMPA受體磷酸化障礙，從而導(dǎo)致LTP受到抑制。 結(jié)論： 急性及亞慢性鋁暴露均會損害大鼠海馬LTP的誘導(dǎo)和維持，這種損害的程度與鋁的劑量有關(guān)，即呈現(xiàn)一定的劑量反應(yīng)關(guān)系。 鋁通過抑制AMPA受體亞單位的外化及合成從而損害大鼠海馬LTP的誘導(dǎo)和維持。 “RAS→PI3K/PKB→GluR1S831和S845位點(diǎn)磷酸化→GluR1插入突觸”通路與鋁損害大鼠海馬LTP有關(guān)。 RAS→MAPK/ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與鋁損害大鼠海馬LTP有關(guān)，但是否是通過引起AMPA受體磷酸化異常進(jìn)而影響AMPA受體外化最終導(dǎo)致LTP損害的還有待于進(jìn)一步研究。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R114

【參考文獻(xiàn)】

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2 袁向飛;陸敏;;Ras/MAPK與PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及其相互作用[J];國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志;2006年03期

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本文編號：2249271