【摘要】：1研究背景 細胞常常受到外界環(huán)境及內(nèi)源性代謝因素如輻射、化學(xué)物和氧化應(yīng)激的攻擊。而這些暴露則可能導(dǎo)致突變和DNA鏈的斷裂,進而引發(fā)基因組不穩(wěn)定性。為了克服環(huán)境有害因子的攻擊并維持基因組穩(wěn)定性,真核細胞通過長期進化,已形成了一種稱為DNA損傷反應(yīng)(DNA damage response, DDR)的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)來感應(yīng)DNA損傷、發(fā)送損傷信號并對之進行修復(fù)。DDR是由多種檢查點蛋白和修復(fù)蛋白構(gòu)成的,而這些相關(guān)蛋白能夠協(xié)調(diào)復(fù)雜的DNA損傷信號級聯(lián)反應(yīng),從而使得細胞發(fā)生細胞周期阻滯以使其有充分的時間來進行DNA修復(fù)或DNA損傷耐受,或者觸發(fā)細胞凋亡。 最近的研究證據(jù)表明,人類DNA聚合酶η(Polη)參與了DDR。 Polη是癌癥易感性疾病—著色性干皮病變種(xeroderma pigmentosum variant, XPV)基因的編碼產(chǎn)物。Polη屬于Y族DNA聚合酶,它能夠催化DNA合成反應(yīng)以跨越因紫外線輻射所產(chǎn)生的能夠阻礙復(fù)制性聚合酶進程的順-反式環(huán)丁烷嘧啶二聚體(cyclobutane pyrimidine dimmers, CPDs)。研究表明,除了CPDs以外,Polη還能夠跨越其它類型的DNA損傷,比如順鉑加合物、丁二烯所誘發(fā)生成的2'-脫氧尿苷以及一氧化氮所產(chǎn)生的加合物2'-脫氧肌苷等。此外,Polη參與了免疫球蛋白基因的體細胞超突變、同源重組和DNA脆性位點的復(fù)制。近年來的研究發(fā)現(xiàn),Polη在人類細胞中參與了抑制8-羥基鳥嘌呤所誘發(fā)的突變,并可阻止基因組不穩(wěn)定性以及與DNA雙鏈斷裂密切相關(guān)的γ-H2AX的形成。這些研究表明,除了參與跨損傷合成所介導(dǎo)的DNA損傷耐受以外,Polη在對各種內(nèi)源性和外源性遺傳毒性因子所致DNA損傷的反應(yīng)當(dāng)中還具有著其它重要的生物學(xué)功能。 氫醌(hydroquinone, HQ)在自然界中天然地存在于細菌、植物和某些動物體內(nèi),也可因商業(yè)用途而被生產(chǎn)出來。目前,HQ主要用于化妝品中的皮膚增白劑、黑白攝影術(shù)的顯影劑、橡膠抗氧化劑、不飽和單體如醋酸乙烯酯和丙烯酸單體的阻聚劑等。HQ也存在煙草、咖啡、麥類制品和紅酒當(dāng)中。人類可以通過環(huán)境、職業(yè)、飲食和吸煙等多種途徑接觸到HQ；也可通過對苯的暴露而接觸到HQ,因為苯可在體內(nèi)代謝為HQ。HQ可經(jīng)皮膚、消化道和呼吸道等途徑吸收,主要在肝臟內(nèi)代謝。 由于HQ應(yīng)用的廣泛性,國內(nèi)外相關(guān)學(xué)者已對之進行了大量的毒性研究。嚙齒類動物的慢性毒性研究表明,HQ可以引起肝腎腫瘤,并可引起白血病。許多研究表明HQ能夠觸發(fā)機體內(nèi)的氧化應(yīng)激過程,從而產(chǎn)生活性氧類,并可通過不同的機制引起明顯的染色體異常和DNA損傷。因此,DNA損傷常被用作HQ的毒性終點。此外,HQ在人體細胞內(nèi)能夠誘發(fā)細胞凋亡,并干擾細胞周期的進展。雖然目前人們對于Polη在跨損傷合成中的作用已有了很好的了解,但是對于其在DDR過程當(dāng)中的作用仍不太明確。 為了更好地理解Polη在人類肝細胞內(nèi)的功能性作用及其重要性,我們采用了RNA干擾(RNA interference, RNAi)技術(shù)來選擇性敲低Polη在肝細胞內(nèi)的表達水平,并通過測定其對細胞增生、細胞凋亡、細胞周期進展和DNA鏈斷裂以及DNA損傷反應(yīng)通路活化程度的影響,以確定肝細胞內(nèi)Polη的缺失是如何影響HQ的細胞毒性及遺傳毒性的。本研究的目的就是初步闡明Polη在肝細胞對HQ所致DNA損傷反應(yīng)中的作用及其機制,從而為建立機體對HQ所致?lián)p傷的防御體系提供科學(xué)的理論依據(jù)。 2研究方法 2.1Polη缺陷肝細胞株的建立及鑒定 根據(jù)POLH的目標序列,使用siRNA設(shè)計軟件設(shè)計了3對編碼shRNAs的寡核苷酸序列和1對編碼非靶向shRNA的寡核苷酸序列,并送于上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成。接著將所合成的shRNA寡核苷酸序列退火,并將之克隆到pLKO.1載體的Agel和EcoRI位點上以產(chǎn)生RNAi載體；接著將這些重組載體轉(zhuǎn)化入感受態(tài)JM109細菌當(dāng)中；收集各細菌克隆以備提取質(zhì)粒之用。然后將陽性克隆進行測序鑒定。將經(jīng)測序鑒定成功的陽性質(zhì)粒分別命名為pLKO.1-POLH1、pLKO.1-POLH2、pLKO.1-POLH3和pLKO.1-C,接著采用脂質(zhì)體2000試劑盒按照使用說明書將各陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293FT細胞,并進行慢病毒顆粒的包裝及濃縮。慢病毒顆粒感染細胞,并采用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定表達POLH shRNA和陰性對照shRNA的細胞株,并將各細胞株分別命名為L02-POLH-sh1、L02-POLH-sh2、L02-POLH-sh3和L02-POLH-nsc(非特異性靶向siRNA對照)細胞。采用實時定量PCR和Western blot技術(shù)分別對POLH的,nRNA及蛋白質(zhì)表達水平進行鑒定。此外,對上述各細胞株的生物學(xué)特征如細胞形態(tài)、細胞增生和細胞周期等進行比較分析。 2.2Polη表達抑制對HQ作用條件下肝細胞的細胞生物學(xué)特征和DNA損傷的影響 (1)將指數(shù)生長期的肝細胞用0、10、20、40、80、160和320gM的HQ作用24h,采用倒置顯微鏡觀察各組細胞的形態(tài)學(xué)特征,并采用MTT法測定細胞存活率。 (2)將L02-POLH-nsc和L02-POLH-sh肝細胞分別用0、10、20和40μM的HQ作用24h,采用流式細胞術(shù)檢測各組細胞的凋亡情況,并采用DAPI熒光染色法觀察各組凋亡細胞的細胞核形態(tài)。 (3)將L02-POLH-nsc和L02-POLH-sh肝細胞分別用0、10、20和40μM的HQ作用24h,采用流式細胞術(shù)檢測細胞周期的分布狀況。每個樣品至少收集10000個細胞,采用FACSAriaTM型流式細胞儀上所附帶的CellQuest軟件對數(shù)據(jù)進行分析,并采用ModFit LT軟件對細胞周期各時相的構(gòu)成比進行量化。 (4)將L02-POLH-nsc和L02-POLH-sh肝細胞分別用0、10、20和40μM的HQ作用24h,采用彗星實驗檢測DNA損傷狀況,采用CASP分析軟件測算每個彗星的相關(guān)參數(shù)；采用激光掃描共聚焦熒光顯微鏡觀察γ-H2AX焦點的生成情況。 2.3Polη表達抑制對HQ作用條件下肝細胞內(nèi)DNA損傷檢查點蛋白的表達、磷酸化及其亞細胞定位的影響 將L02-POLH-nsc和L02-POLH-sh肝細胞分別用0、10、20和40μM的HQ作用24h,采用實時定量PCR方法檢測各DNA損傷檢查點基因(ATM、ATR, Chk1、Chk2、p53、H2AX和RPA2)的mRNA表達水平,并采用RQ Manager1.2軟件對各目的基因mRNA表達水平進行相對定量分析。采用Western blot檢測DNA損傷檢查點蛋白(ATM、ATR、Chk1、Chk2、p53、H2AX和RPA2)及其磷酸化蛋白(p-Chk1、p-Chk2、p-p53、y-H2AX和P-RPA2)進行檢測,并采用ImageJ軟件對各目的蛋白條帶的灰度值進行分析。采用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察各DNA損傷檢查點蛋白的亞細胞定位特征。 2.4實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)分析 所有實驗數(shù)據(jù)都以均數(shù)±標準差表示,采用SPSS14.0for windows軟件對之進行統(tǒng)計分析。兩組間的比較采用t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析,當(dāng)組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義時,采用Tukey法進行任兩組之間的比較；規(guī)定P0.05時,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。 3研究結(jié)果 3.1Polη缺陷肝細胞株的建立及鑒定 實時熒光定量PCR實驗結(jié)果顯示,與未轉(zhuǎn)染對照組細胞即正常L-02肝細胞相比較,L02-POLH-sh1、L02-POLH-sh2和L02-POLH-sh3細胞內(nèi)POLH基因mRNA表達的抑制率分別為61%、60%和82%,差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；而L-02肝細胞、L02-POLH-nvc和L02-POLH-nsc細胞POLH基因mRNA表達水平之間的差別卻無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。Western blot實驗結(jié)果顯示,L02-POLH-sh1、 L02-POLH-sh2和L02-POLH-sh3細胞內(nèi)Polη在蛋白質(zhì)表達水平上的抑制率分別為57.46%、71.49%和85.84%,與L-02細胞相比較,差別也有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；而L-02肝細胞、L02-POLH-nvc和L02-POLH-nsc細胞內(nèi)Polη的蛋白質(zhì)表達水平之間的差別則無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。此外,L02-POLH-sh1、L02-POLH-sh2、 L02-POLH-sh3,L02-POLH-nsc、L02-POLH-nvc和L-02細胞在細胞生物學(xué)特征方面沒有明顯差別。由于PoIη在L02-POLH-sh3細胞內(nèi)的抑制效率最好,因此將L02-POLH-sh3命名為L02-POLH-sh,并作為后續(xù)研究的工具細胞。 3.2Polη表達抑制對HQ作用條件下肝細胞的細胞生物學(xué)特征和DNA損傷的影響 (1)MTT實驗結(jié)果顯示,與未處理對照組相比較,其中10、20、40和80μM的HQ對L-02、L02-POLH-nsc肝細胞的相對存活率沒有明顯影響(P0.05),而160和320μM的HQ則可明顯降低肝細胞的存活水平,與未處理對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。而對于L02-POLH-sh細胞而言,10和20μM組與未處理對照組相比較,細胞相對存活率無明顯差異(P0.05)；當(dāng)HQ作用劑量高于40μM就可導(dǎo)致細胞活力的明顯降低(P0.01)。L02-POLH-sh細胞對HQ的敏感性明顯高于g-02和L02-POLH-nsc細胞。此外,細胞的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果與MTT實驗結(jié)果相符。 (2)流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,在0～40μM濃度范圍內(nèi),HQ可誘導(dǎo)L02-POLH-nsc和L02-POLH-sh細胞發(fā)生凋亡,并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。對L02-POLH-nsc細胞而言,0、10、20和40gM劑量組的細胞調(diào)亡率依次為：2.73%、3.77%、5.27%、6.63%；而對L02-POLH-sh細胞而言,0、10、20和40μM劑量組的細胞調(diào)亡率則依次為：3.24%、6.78%、10.70%、14.03%；并且各處理組與未處理對照組相比較,均明顯地高于未處理對照組(P0.05)。在相同的作用劑量條件下,HQ對L02-POLH-sh細胞所誘發(fā)的凋亡率明顯地高于L02-POLH-nsc細胞(P0.01)；而在0gM的HQ作用條件下,L02-POLH-nsc和L02-POLH-sh細胞之間的凋亡率差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。此外,DAPI熒光染色法實驗結(jié)果與上述流式細胞術(shù)的檢測結(jié)果基本相符。 (3)流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,HQ作用后,L02-POLH-nsc和L02-POLH-sh細胞的細胞周期各時相分布特征發(fā)生了明顯地改變,表現(xiàn)為G1期細胞比例的減少、S期和G2期細胞比例的相應(yīng)增加。對于L02-POLH-nsc細胞而言,10μM和20μM組的S期細胞比例與未處理對照組相比較其差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),而40μM組的S期細胞比例則明顯地高于未處理組(P0.05),其數(shù)值分別由未處理組的25.93%增加至27.54%、27.93%和35.02%。而對于L02-POLH-sh細胞來說,10、20和40μM的HQ與未處理對照組相比較均可引起S期細胞的明顯增加(P0.05),其具體數(shù)值分別由未處理組的27.80%增加至36.42%(10μM組)、40.72%(20μM組)和44.42%(40μM組)。此外,在相同的HQ作用劑量(10、20或40gM)下,與L02-POLH-nsc細胞相比較,L02-POLH-sh細胞的S期細胞比例均有明顯地增加(P0.05)。 (4)彗星實驗結(jié)果顯示,HQ以劑量依賴性的方式誘導(dǎo)L02-POLH-nsc和L02-POLH-sh細胞DNA損傷水平增加。在相同的HQ作用劑量條件下, L02-POLH-sh細胞DNA損傷的程度明顯地大于L02-POLH-nsc細胞,差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。細胞免疫熒光聯(lián)合激光掃描共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示,HQ作用后,L02-POLH-nsc和L02-POLH-sh細胞內(nèi)的y-H2AX焦點數(shù)均有隨著HQ作用劑量的增加而增加的趨勢,并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性；在相同的HQ作用劑量條件下,L02-POLH-sh細胞內(nèi)的y-H2AX焦點數(shù)明顯地多于L02-POLH-nsc細胞(P0.05)。 3.3Polη表達抑制對HQ作用條件下肝細胞內(nèi)DNA損傷檢查點蛋白的表達、磷酸化及其亞細胞定位的影響 (1)實時定量PCR實驗結(jié)果顯示,HQ能夠誘導(dǎo)ATM、ATR、 CHK1、CHK2.P53和RPA2基因的mRNA表達水平在L02-POLH-nsc和L02-POLH-sh細胞內(nèi)以劑量依賴性方式增加；在相同的HQ作用條件下,L02-POLH-sh細胞內(nèi)CHK1、P53和RPA2基因的mRNA表達水平明顯地高于L02-POLH-nsc細胞。 (2) Western blot分析結(jié)果顯示,HQ能夠在L02-POLH-nsc和L02-POLH-sh細胞內(nèi)誘導(dǎo)ATM、ATR、Chk2、p53、RPA2、p-chk1、 p-chk2、p-p53、p-RPA2和γ-H2AX的蛋白表達水平增加。HQ能夠在L02-POLH-sh細胞誘導(dǎo)Chk1蛋白表達水平的升高,而在L02-POLH-nsc細胞內(nèi)卻無此現(xiàn)象。此外,在相同的HQ作用條件下,L02-POLH-sh細胞內(nèi)Chk1、p53、RPA2、p-chk1、p-chk2、p-p53、 P-RPA2和γ-H2AX的蛋白表達水平明顯地高于L02-POLH-nsc細胞。 (3)細胞免疫熒光實驗結(jié)果顯示,HQ能夠在L02-POLH-nsc和L02-POLH-sh細胞內(nèi)誘導(dǎo)ATM、ATR、Chk1、Chk2、p53、RPA2、 p-chk1、p-chk2、p-p53、p-RPA2和γ-H2AX熒光強度的增加。在相同的HQ作用條件下,L02-POLH-sh細胞內(nèi)Chk1、p53、RPA2、 p-chk1、p-chk2、p-p53、p-RPA2和γ-H2AX的熒光強度明顯地高于L02-POLH-nsc細胞。各目的蛋白的亞細胞定位分析結(jié)果顯示,HQ能夠?qū)е翧TM和Chk2從細胞核移位到細胞漿；而Polη的缺陷則會導(dǎo)致Chk1和p53從細胞漿移位至細胞核內(nèi)。此外,RPA2在L02-POLH-nsc和L02-POLH-sh細胞內(nèi)能夠與γ-H2AX共定位在一起,并且該種共定位會隨著HQ作用劑量的增加而增強。此外,Polη的抑制會使RPA2與γ-H2AX的共定位效應(yīng)得到明顯的增強。 4結(jié)論 (1)本研究采用RNA干擾技術(shù)成功建立了Polη缺陷的肝細胞株,這為進一步的實驗研究提供了基礎(chǔ)。 (2)Polη表達的抑制導(dǎo)致了HQ作用條件下肝細胞增生的減少,并使肝細胞對HQ所致細胞毒性的敏感性增強。 (3) Polη的缺陷明顯增加了HQ所致肝細胞DNA雙鏈斷裂的形成或積累程度。 (4) Polη表達的抑制在肝細胞內(nèi)增強了HQ所誘發(fā)的細胞凋亡效應(yīng),并增強了HQ在肝細胞內(nèi)所引起的細胞周期的S期阻滯現(xiàn)象。 (5)HQ作用條件下,Polη的缺陷明顯增加了Chk1、p53和RPA2在肝細胞內(nèi)的表達水平及其在細胞核內(nèi)的定位。 (6)HQ可在肝細胞內(nèi)引起DNA損傷檢查點蛋白Chk1、Chk2、 p53、H2AX和RPA2的強烈磷酸化；并且這些蛋白的磷酸化效應(yīng)在Polη有缺陷的肝細胞內(nèi)得到了明顯的增強。 (7)Polη可能通過調(diào)節(jié)細胞增生、凋亡、細胞周期進程、DNA雙鏈斷裂修復(fù)和DNA損傷檢查點蛋白的活化而在肝細胞對HQ所引起的DNA損傷反應(yīng)當(dāng)中發(fā)揮著重要的作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R114

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