【摘要】：目的：以上轉(zhuǎn)發(fā)光(Up-Converting Phospher, UCP)材料作為標記物,與經(jīng)典免疫層析方法結(jié)合,建立可對奶制品中黃曲霉毒素M1及糧食中黃曲霉毒素B1直接進行現(xiàn)場檢測的上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫層析(up-converting phosphor technology-based lateral-flow, UPT-LF)'決速定量檢測方法。方法：1.上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫層析試紙制備：分別以黃曲霉毒素M1(AFM1)單克隆抗體,黃曲霉毒素Ml (AFM1)與小牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)物：AFM1-BSA;黃曲霉毒素Bl (AFB1)單克隆抗體,黃曲霉毒素B1(AFB1)與小牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)物：AFB1-BSA作為特異性生物探針,以UCP顆粒作為標記物,采用競爭免疫反應作為檢測模型,分別建立免疫層析試紙：黃曲霉毒素Ml上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫層析檢測試紙(UPT-LF-AFM1)及黃曲霉毒素B1上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫層析檢測試紙(UPT-LF-AFB1).2.上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫層析檢測試紙性能評價：1) UPT-LF-AFM1:配置系列濃度AFM1毒素標準品,評價UPT-LF-AFM1包括檢測敏感性、線性、精密性在內(nèi)的檢測性能。對實際牛奶及奶粉樣品同時進行UPT-LF-AFM1及LC-MS檢測,評價UPT-LF-AFM1對實際樣品的定性及定量檢測能力。2)UPT-LF-AFB1:配置系列濃度AFB1毒素標準品,評價UPT-LF-AFB1包括檢測敏感性、線性、精密性在內(nèi)的檢測性能,同時以其余相關生物毒素標準品評價UPT-LF-AFB1檢測特異性。將AFB1毒素標準品添加到實際糧食樣品中作為檢測樣品,評價UPT-LF-AFB1對實際樣品的檢測能力及其耐受性。結(jié)果：1.上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫層析試紙制備：1) UPT-LF-AFM1:將抗AFM1單克隆抗體、羊IgG分別與UCP顆粒共價偶聯(lián),用結(jié)合物稀釋液將兩種結(jié)合物等比混合,以終濃度1.5mg·mL-1浸泡玻璃纖維作為結(jié)合墊。AFM1-BSA與兔抗羊IgG分別配制為0.5 mg·mL-1、0.3 mg·mL-1,以2μL·cm-1噴點于分析膜上作為檢測帶(T)與質(zhì)控帶(C)。2)UPT-LF-AFB1:將抗AFB1單克隆抗體、兔抗羊IgG分別與UCP顆粒共價偶聯(lián),用結(jié)合物稀釋液將兩種結(jié)合物等比混合,以終濃度1mg·mL-1浸泡玻璃纖維作為結(jié)合墊。AFB1-BSA與羊IgG均配制為0.5mg·mL-1,以2μL·cm-1噴點于分析膜上作為檢測帶(T)與質(zhì)控帶(C)。2.上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫層析檢測試紙性能評價：1) UPT-LF-AFM1:對奶粉中AFM1檢測敏感性可達O.lppb (μg·Kg-1)、在0.1～0.7ppb (μg·Kg-1)間具有較好線性(r=-0.99359,P=0.00641)；牛奶中AFM1檢測敏感性可達0.3ppb (μg·L-1),在0.3-0.7ppb((μg·L-1)間具有較好線性(r=-0.99938,P0.05),每個濃度重復測量的變異系數(shù)小于15%。在定性檢測評價中,對奶粉檢測靈敏度Se=100%,特異度Sp=85%,ROC曲線下面積為0.978±0.036；牛奶檢測中靈敏度Se=81%,特異度Sp=88%,ROC曲線下面積為0.891±0.099：與LC-MS結(jié)果進行x2檢驗,無顯著差異(P0.05)。在定量檢測評價中,UPT-LF-AFM1對于奶粉及牛奶中AFM1檢測均具有較好回收率,與LC-MS比較無明顯差異(奶粉：t=0.66,P0.05；牛奶：t=1.01,P0.05)。2) UPT-LF-AFB1:對AFB1檢測敏感性可達0.03ng·mL-1,在0.03-1000ng·mL-1間具有較好線性(r=-0.98459,P0.0001),每個濃度重復檢測變異系數(shù)小于10%。特異性較優(yōu),除與結(jié)構相似的AFM1存在一定程度的交叉反應外,與赭曲霉毒素、蓖麻毒素、肉毒毒素等七種毒素均無交叉反應。UPT-LF-AFB1對包括花生、大紅豆、玉米等在內(nèi)的15種糧食樣本耐受性均較優(yōu),均可滿足國標中限量標準檢測要求。結(jié)論：本研究建立了可分別對奶制品中黃曲霉毒素M1及糧食中黃曲霉毒素B1進行快速定量檢測的上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫層析試紙條,操作簡便快捷,無需復雜前處理,具有良好的檢測敏感性及特異性,對各實際樣品耐受性較好,可滿足食品安全中對現(xiàn)場快速檢測的需求。
[Abstract]:OBJECTIVE: To establish an up-converting phosphor technology-based lateral-flow (UPT-LF)'determination method for aflatoxin M1 in dairy products and aflatoxin B1 in grains by using UCP materials as markers combined with classical immunochromatographic methods. Quantitative detection methods: 1. Upper-forward photoimmunochromatographic strip preparation: aflatoxin M1 (AFM1) monoclonal antibody, aflatoxin Ml (AFM1) and bovine serum albumin (BSA) conjugate: AFM1-BSA; aflatoxin Bl (AFB1) monoclonal antibody, aflatoxin B1 (AFB1) and bovine serum albumin (BSA) conjugate: AFB1 BSA as a specific biological probe, UCP particles as a marker, competitive immune response as a detection model, respectively, established immunochromatographic test paper: aflatoxin ml on the transfer of photoimmunochromatographic detection paper (UPT-LF-AFM1) and aflatoxin B1 on the transfer of photoimmunochromatographic detection paper (UPT-LF-AFB1). 2. Performance evaluation of test paper: 1) UPT-LF-AFM1: Configuration of a series of concentration of AFM1 toxin standard, evaluation of UPT-LF-AFM1 including detection sensitivity, linearity, precision, including detection performance. For actual milk and milk powder samples, UPT-LF-AFM1 and LC-MS detection were carried out simultaneously to evaluate the UPT-LF-AFM1 on the actual samples of qualitative and quantitative detection capacity.2) UPT-LF-AF 1 on the actual samples. B1: A series of AFB1 toxin standards were prepared to evaluate the detection performance of UPT-LF-AFB1, including sensitivity, linearity and precision. The specificity of UPT-LF-AFB1 was evaluated by other related biological toxin standards. RESULTS: 1. UPT-LF-AFM1: Anti-AFM1 monoclonal antibody, sheep IgG were covalently coupled with UCP granules, and the two conjugates were mixed with the conjugate diluent at the same ratio. The final concentration of 1.5mg. mL-1 immersed glass fiber was used as the binding pad. AFM1-BSA and rabbit anti-sheep IgG were matched respectively. Anti-AFB1 monoclonal antibody, rabbit anti-sheep IgG covalently coupled with UCP granules, and rabbit anti-sheep IgG covalently coupled with UCP granules. The conjugates were mixed equally with the diluent of conjugates, and the glass fibers were immersed in the final concentration of 1 mg mL-1 as a bonding pad. The results showed that: 1) UPT-LF-AFM1 had a good linearity (r=-0.99359, P=0.00641) between 0.1 and 0.7 ppb (ug.Kg-1) for the detection of AFM1 in milk powder. The sensitivity of AFM1 in milk was 0.3 ppb (ug.L-1), good linearity between 0.3 and 0.7 ppb ((ug.L-1)) (r=-0.99938, P 0.05), and the coefficient of variation of repeated measurements for each concentration was less than 15%. In qualitative evaluation, the sensitivity of the milk powder was Se=100%, specificity was Sp=85%, and the area under the ROC curve was 0.978+0.036. E = 81%, specificity Sp = 88%, ROC curve area under 0.891 + 0.099: No significant difference (P 0.05). In quantitative evaluation, UPT-LF-AFM1 has a good recovery rate for the detection of AFM1 in milk powder and milk, compared with LC-MS, there is no significant difference (milk powder: t = 0.66, P 0.05; milk: t = 1.01, P 0.05). 2) UPT-LF-AFB1: The sensitivity to AFB1 was 0.03 ng mL 1, and it had a good linearity between 0.03 and 1000 ng mL 1 (r = - 0.98459, P 0.0001). The coefficient of variation was less than 10% for each concentration. The specificity was better, and there was no cross reaction with ochratoxin, ricin, botulinum toxin and other seven toxins except for the cross reaction with similar structure of AFM1. UPT-LF-AFB1 has good tolerance to 15 kinds of grain samples, including peanut, red bean, corn and so on. All of them can meet the requirements of the national standard medium-limit detection. CONCLUSION: The UPT-LF-AFB1 can be used to detect aflatoxin M1 in dairy products and aflatoxin B1 in grain quantitatively and rapidly. It is easy to operate and needs no complex pretreatment. It has good sensitivity and specificity. It has good tolerance to various actual samples. It can meet the requirements of rapid on-site detection in food safety.
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R155.5

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本文編號：2237887