【摘要】：目的： 1建立食源性金黃色葡萄球菌14種腸毒素基因的多重PCR檢測(cè)方法，調(diào)查石家莊地區(qū)食源性金葡菌中腸毒素基因的分布狀況。 2設(shè)計(jì)食源性金葡菌的MLVA分型方法，比較MLST、MLVA、PFGE三種基因分型方法在食源性金葡菌基因多樣性研究中的優(yōu)劣勢(shì)。 方法： 1對(duì)93株食源性金葡菌進(jìn)行復(fù)蘇傳代培養(yǎng)，用試劑盒提取基因組DNA； 2設(shè)計(jì)14種腸毒素基因A、B、C、D、E、G、H、J、K、L、M、N、Q、U的PCR引物，通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件確定多重PCR反應(yīng)體系，對(duì)石家莊地區(qū)分離的93株食源性金葡菌進(jìn)行腸毒素基因的檢測(cè)； 3參考相關(guān)文獻(xiàn)，結(jié)合網(wǎng)站數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)金葡菌的MLVA分型方法。應(yīng)用MLST、MLVA、PFGE三種方法分別對(duì)26株食源性金葡菌進(jìn)行基因分型，對(duì)分型結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析。 結(jié)果： 193株食源性金葡菌均成功復(fù)蘇，提取的基因組DNA濃度和純度均符合實(shí)驗(yàn)需求。 2設(shè)計(jì)的14種腸毒素基因PCR引物除SEE外，均擴(kuò)增到了目的基因片段，雙向測(cè)序結(jié)果在GeneBank上進(jìn)行BLAST比對(duì)，證實(shí)為腸毒素基因的目的片段。 3設(shè)計(jì)優(yōu)化的多重PCR反應(yīng)體系能夠成功擴(kuò)增到食源性金葡菌的腸毒素基因目的片段，經(jīng)檢測(cè)，93株食源性金葡菌中79株檢出含有腸毒素基因，腸毒素基因的檢出率為84.95%；其中檢出SEA的有55株（59.14%），SEG32株（34.41%），SEM32株（34.41%），SEK25株（26.88%），SEB22株（23.66%），SEU21株（22.58%），，SEN20株（21.51%），SEH16株（17.20%），SEJ15株（16.13%），SEC14株（15.05%），SED13株（13.98%），SEQ13株（13.98%），SEL7株（7.53%）；此外，57株金葡菌（61.29%）被檢出同時(shí)含有兩種或兩種以上腸毒素基因，其中有1株檢測(cè)到同時(shí)含有10種腸毒素基因，3株檢測(cè)到同時(shí)含有9種，3株檢測(cè)到同時(shí)含有8種。 4MLST分型將26株金葡菌分成8個(gè)ST序列型，其中ST59型11株，均來(lái)自同一起食物中毒分離獲得的菌株；ST5型5株，ST464型3株，ST7型和ST15型各2株；此外還獲得了一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的ST序列型，已提交MLST國(guó)際數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行確認(rèn)并收錄。 5設(shè)計(jì)的MLVA方法具有較好的分型力和可重復(fù)性，26株食源性金葡菌經(jīng)此方法成功分為10個(gè)基因型，其中VA05型11株，均為一起食物中毒中分離的菌株，VA07型4株，VA01型、VA09型和VA10型各兩株，其他各一株。 6PFGE分型將26株金葡菌分為9組共13個(gè)基因型，其中A組共11株，均為一起食物中毒中分離的菌株，B組有4個(gè)亞型共4株，C組有兩個(gè)亞型共3株，D組和E組各兩株，其他組各一株。 結(jié)論： 1設(shè)計(jì)的14種腸毒素基因PCR引物以及多重PCR反應(yīng)體系具有較好的穩(wěn)定性，能夠用于食源性金黃色葡萄球菌腸毒素基因的快速檢測(cè)。 2MLVA的分型力較MLST強(qiáng)，但是不及PFGE。 3與MLST和PFGE相比，設(shè)計(jì)的MLVA分型方法具有快速簡(jiǎn)便、穩(wěn)定性好、分型力較高等優(yōu)點(diǎn)，可用于食源性金葡菌的快速基因分型。
[Abstract]:Objective: 1 to establish a multiplex PCR method for the detection of 14 enterotoxin genes of foodborne Staphylococcus aureus. To investigate the distribution of enterotoxin gene of Staphylococcus aureus in Shijiazhuang area. (2) to design the MLVA genotyping method of Staphylococcus aureus and compare the advantages and disadvantages of the three genotyping methods in the study of genetic diversity of Staphylococcus aureus. Methods: (1) 93 strains of Staphylococcus aureus were resuscitated and cultured, and genomic DNA was extracted by kit. (2) PCR primers were designed for 14 enterotoxin genes, the PCR primers were designed to determine the multiplex PCR reaction system by optimizing the reaction conditions. The enterotoxin genes of 93 strains of foodborne Staphylococcus aureus isolated in Shijiazhuang area were detected. (3) the MLVA typing method of Staphylococcus aureus was designed with reference to relevant literature and data from the website. The alleles of 26 strains of Staphylococcus aureus were genotyped by MLST-MLVAA-PFGE, and the results were compared and analyzed. Results: 193 strains of Staphylococcus aureus foodborne were successfully resuscitated, and the genomic DNA concentration and purity all met the experimental requirements. 2 the designed PCR primers of 14 enterotoxin genes were amplified with the exception of SEE. The results of bidirectional sequencing on GeneBank showed that it was the target fragment of enterotoxin gene. 3 the designed and optimized multiplex PCR reaction system could successfully amplify the target fragment of enterotoxin gene of Staphylococcus aureus. 緇忔嫻

本文編號(hào)：2190434