本文選題：三氯化銻 + 呼吸系統(tǒng)��； 參考：《浙江大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：目的銻是一種銀白色重金屬,其化合物被廣泛應(yīng)用于顏料、陶瓷、煙火、玻璃、阻燃劑和汽車剎車片等器材的制造。隨著銻礦開采、冶煉及銻加工相關(guān)產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展,大量銻被釋放到大氣中,使職業(yè)性銻暴露人群增加,其健康危害越來越受關(guān)注。職業(yè)性銻暴露主要經(jīng)呼吸道進入人體,可引起上呼吸道刺激癥狀和肺損傷。然而,目前關(guān)于銻與職業(yè)人群呼吸系統(tǒng)健康效應(yīng)的研究主要集中在流行病學(xué)調(diào)查方面,毒性機理研究較少,缺乏細胞和分子水平的機制解釋。本學(xué)位論文以三氯化銻(SbCl_3)為研究對象,分析銻暴露在肺腺癌上皮細胞A549和支氣管上皮細胞BEAS-2B兩種呼吸系統(tǒng)細胞模型中的生物學(xué)效應(yīng),探究銻所致的細胞氧化應(yīng)激機制,并通過干預(yù)不同來源的氧化應(yīng)激來進一步驗證,從而確立氧化應(yīng)激在銻致呼吸系統(tǒng)細胞損傷中的作用,為銻致呼吸系統(tǒng)損傷的干預(yù)提供實驗依據(jù)。方法首先采用CCK-8檢測細胞活力、PI染色結(jié)合細胞流式檢測細胞周期、Annexin-V染色結(jié)合細胞流式檢測細胞凋亡、DCFH-DA探針孵育結(jié)合細胞流式檢測細胞ROS水平等方法,探究銻處理后細胞產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)。由于細胞內(nèi)ROS的主要來源為胞漿NADPH氧化酶(NOX)家族或線粒體,本論文進一步采用胞漿ROS探針DHE染色、線粒體ROS探針MitoSOXTM染色結(jié)合細胞流式檢測、實時熒光定量PCR、蛋白免疫印跡等技術(shù)分析胞漿、線粒體產(chǎn)生ROS相關(guān)關(guān)鍵分子表達水平。最后,采用NADPH氧化酶抑制劑DPI和線粒體ROS清除劑Mito-TEMPO預(yù)處理細胞后再進行銻處理,證實不同氧化應(yīng)激途徑在銻致細胞損傷效應(yīng)中的貢獻。結(jié)果1.銻對A549細胞的毒性效應(yīng)(1)CCK-8實驗結(jié)果顯示,銻處理24h后可致A549細胞活力下降;利用流式細胞儀對細胞凋亡率進行檢測,發(fā)現(xiàn)細胞凋亡率無明顯上升;PI染色細胞周期檢測顯示,細胞在G2/M期顯著阻滯;蛋白免疫印跡檢測證明,細胞相關(guān)周期蛋白CyclinA、CyclinB及蛋白激酶Cdk2、Cdk1表達均下調(diào)。(2)DCFH-DA探針孵育結(jié)合細胞流式檢測顯示,銻處理后可引起A549細胞ROS水平增加,即誘發(fā)氧化應(yīng)激;加入抗氧化劑NAC處理后,能夠顯著減輕細胞G2/M期阻滯,使細胞活力恢復(fù)。(3)胞漿ROS探針DHE染色檢測發(fā)現(xiàn),A549細胞胞漿ROS水平?jīng)]有明顯變化,NADPH氧化酶(NOX)家族成員NOX1、NOX2、NOX5的mRNA及蛋白水平均無明顯變化;使用NADPH氧化酶抑制劑DPI處理細胞后,細胞活力并未出現(xiàn)顯著回復(fù)。線粒體ROS探針MitoSOXTM染色結(jié)合細胞流式檢測顯示,A549細胞線粒體mtROS水平升高;使用線粒體ROS特異性清除劑Mito-TEMPO處理后,細胞周期阻滯減輕,周期蛋白及蛋白激酶表達恢復(fù),細胞活力得到回復(fù)。2.銻對BEAS-2B細胞的毒性效應(yīng)(1)CCK-8實驗結(jié)果顯示,銻處理24h后可致BEAS-2B細胞活力下降;利用流式細胞儀檢測細胞凋亡率,發(fā)現(xiàn)銻處理后細胞凋亡率顯著增加。(2)DCFH-DA探針孵育結(jié)合細胞流式檢測顯示,銻處理后可引起B(yǎng)EAS-2B細胞ROS水平增加;加入抗氧化劑NAC處理后,能夠顯著降低細胞凋亡率,恢復(fù)細胞活力。(3)胞漿ROS探針DHE染色檢測發(fā)現(xiàn),BEAS-2B細胞胞漿ROS水平上調(diào),NADPH氧化酶家族NOX1、NOX5的mRNA及蛋白水平均上調(diào);使用DPI處理細胞后,細胞活力部分回復(fù)。采用MitoSOXTM染色結(jié)合細胞流式檢測發(fā)現(xiàn),細胞線粒體mtROS水平升高;Mito-TEMPO處理后細胞活力部分回復(fù)。同時采用DPI和Mito-TEMPO預(yù)處理BEAS-2B細胞后,細胞凋亡率顯著降低,細胞活力得到回復(fù)。結(jié)論(1)銻暴露誘導(dǎo)A549細胞產(chǎn)生ROS,并導(dǎo)致細胞周期阻滯于G2/M期,細胞活力下降。(2)線粒體ROS清除劑能顯著回復(fù)銻暴露引起的A549細胞周期阻滯和細胞活力下降,而NADPH氧化酶抑制劑則沒有類似回復(fù)效應(yīng),說明線粒體ROS在銻誘導(dǎo)的A549細胞損傷中起主要作用。(3)銻暴露誘導(dǎo)支氣管上皮BEAS-2B細胞產(chǎn)生ROS,使細胞活力下降,并誘導(dǎo)細胞凋亡;(4)線粒體ROS清除劑和NADPH氧化酶抑制劑預(yù)處理能抑制銻暴露引起的BEAS-2B細胞損傷,提示線粒體和胞漿NADPH氧化酶均為銻引起的BEAS-2B細胞氧化應(yīng)激產(chǎn)生的主要來源。綜上,本論文研究證明:氧化應(yīng)激是銻發(fā)揮毒性作用的機制之一;針對氧化應(yīng)激產(chǎn)生的不同來源進行干預(yù),調(diào)控細胞內(nèi)活性氧的生成,有助于促進呼吸系統(tǒng)上皮細胞修復(fù)和存活,對銻引起的呼吸系統(tǒng)損傷起到保護作用。
[Abstract]:Objective To study the biological effects of antimony on the apoptosis of lung adenocarcinoma epithelial cells ( A549 ) and bronchial epithelial cells ( BEAS - 2B ) . ( 2 ) After treated with anti - oxidant NAC , the cell viability of BEAS - 2B cells increased . After treated with the inhibitor of NADPH oxidase , the cell viability of BEAS - 2B cells was increased . ( 2 ) mitochondrial ROS scavenging agents can significantly restore the cell cycle arrest and cell viability of A549 cells induced by antimony exposure , while NADPH oxidase inhibitors do not have similar recovery effects , suggesting that mitochondrial ROS play a major role in antimony - induced oxidative stress in BEAS - 2B cells .
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R114

【參考文獻】

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本文編號：2017242