本文選題：避孕疫苗 + Eppin��； 參考：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2013年博士論文

【摘要】：近年來，以附睪蛋白酶抑制蛋白(epidydimal protease inhibitor，Eppin)為靶點(diǎn)的避孕疫苗研究取得了一定的進(jìn)展，但仍存在以下問題：(1)采用Eppin優(yōu)勢表位疫苗進(jìn)行免疫能減少不良反應(yīng)，但免疫原性差；(2)表位交聯(lián)載體蛋白可以增強(qiáng)免疫原性，但抗體特異性差；(3) Eppin避孕疫苗的實(shí)驗研究中通常聯(lián)合使用免疫佐劑如弗氏佐劑，其在人體中的應(yīng)用存在安全性問題；因此，解決這一問題的關(guān)鍵在于構(gòu)建更加安全、有效的避孕疫苗運(yùn)載體系。本研究以篩選的優(yōu)勢表位為基礎(chǔ)，設(shè)計構(gòu)建多價表達(dá)抗原的E-Q11自組裝納米肽避孕疫苗，體外實(shí)驗研究樹突狀細(xì)胞(dendritic cell, DC)對疫苗的攝取及免疫應(yīng)答，建立避孕疫苗經(jīng)皮微針免疫方法，對E-Q11自組裝多肽的體內(nèi)免疫效應(yīng)和抗生育效應(yīng)進(jìn)行研究。課題分為三個部分。 一、E-Q11自組裝肽的構(gòu)建及表征 將前期篩選的Eppin優(yōu)勢抗原表位與具有多價抗原表達(dá)特征的自組裝納米肽(QQKFQFQFEQQ，Q11)進(jìn)行偶聯(lián)，采用人工合成肽技術(shù)固相合成融合多肽E-Q11，通過調(diào)整自組裝條件制備E-Q11自組裝納米疫苗。結(jié)果表明，采用全化學(xué)合成方法獲得的融合多肽E-Q11純度大于90%，，并能在PBS中完成自組裝，圓二色譜分析E-Q11肽具有β折疊二級結(jié)構(gòu)，透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)E-Q11肽能夠自組裝形成納米纖維結(jié)構(gòu)，ELISA實(shí)驗證實(shí)E-Q11肽能與抗血清發(fā)生的結(jié)合反應(yīng)。 二、E-Q11自組裝肽誘導(dǎo)小鼠骨髓樹突狀細(xì)胞的免疫應(yīng)答 分離培養(yǎng)小鼠骨髓樹突狀細(xì)胞(mouse bone marrow derived DCs, mBMDCs)，加入不同濃度的E-Q11自組裝肽和E肽進(jìn)行刺激，觀察mBMDCs吞噬及分析成熟表型；檢測免疫小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞與抗原負(fù)載DC共培養(yǎng)上清中的細(xì)胞因子。結(jié)果表明，通過雙因子誘導(dǎo)法獲得了CD11c表達(dá)率超過70%的DC；E-Q11自組裝肽能被未成熟mBMDCs吞噬，DC成熟表型CD40和CD80表達(dá)明顯增高；E-Q11自組裝肽組的上清中IFN-γ較rhEppin組和E肽組明顯降低，而IL-4高于其他兩組，提示E-Q11自組裝肽能夠誘導(dǎo)Th2細(xì)胞極化。 三、E-Q11自組裝肽經(jīng)皮微針免疫方法的建立及動物實(shí)驗研究 選擇商品化微針構(gòu)建抗原包被微針疫苗，建立避孕疫苗經(jīng)皮微針免疫方法。選擇C57BL/6小鼠進(jìn)行免疫，具體分組為：抗原(E肽、E-Q11自組裝肽和rhEppin)，免疫劑量(10μg和80μg)，免疫途徑(微針(MN)和皮下(SC))，以及陰性對照組PBS共10組。ELISA監(jiān)測免疫前后各時間點(diǎn)的抗體滴度及分析抗體亞型，ELISPOT分析Th1/Th2極化，合籠觀察雌鼠受孕率及產(chǎn)仔率，檢測附睪精子數(shù)、活力及低滲腫脹率。結(jié)果表明： 1.500μm長度的微針適合用于小鼠微針免疫，熒光抗原包被的微針刺入小鼠皮膚能在60s內(nèi)釋放78%的抗原量，微針能有效包被上述三種抗原。 2.除E肽免疫組和低劑量rhEppin皮下免疫組外，其余各組抗體滴度在初免后2周開始逐漸上升，于免疫結(jié)束后2~4周達(dá)到高峰，持續(xù)8~9個月。低劑量E-Q11自組裝肽和rhEppin微針免疫比低劑量皮下免疫抗體反應(yīng)強(qiáng)，與高劑量皮下免疫的抗體反應(yīng)水平相似。提示E-Q11自組裝肽能顯著增強(qiáng)Eppin表位疫苗的免疫原性，避孕疫苗經(jīng)皮微針免疫具有劑量節(jié)省效應(yīng)。 3.高劑量rhEppin皮下免疫組小鼠產(chǎn)生了高水平的IgG1和IgG2a抗體亞型，以及IFNγ分泌細(xì)胞。而E-Q11自組裝肽免疫組和rhEppin微針免疫組小鼠的抗體亞型主要為IgG1。采用微針免疫時，各組小鼠IL-4分泌細(xì)胞增多而IFN-γ分泌細(xì)胞減少。采用皮下免疫時，E-Q11自組裝肽免疫小鼠的IFN-γ分泌細(xì)胞明顯低于rhEppin組。提示采用E-Q11自組裝肽和經(jīng)皮微針免疫途徑能增強(qiáng)Th2型免疫反應(yīng)。 4. E-Q11自組裝肽免疫組小鼠的生育力均受到抑制，其中微針組受孕率最低(20%)，而E肽免疫組小鼠受孕率均未下降，rhEppin免疫小鼠中，微針組與高劑量皮下組受孕率分別為26.6%和13.3%，而低劑量皮下組受孕率無明顯下降。各組小鼠的生育力于36周后均得到恢復(fù)。各實(shí)驗組與PBS對照組相比，精子計數(shù)無明顯變化，而精子活力和HOS%顯著下降。提示避孕疫苗經(jīng)皮微針免疫與皮下注射相比能提高疫苗保護(hù)效率和生物利用度，E-Q11自組裝肽納米疫苗具有良好的安全性和有效性。
[Abstract]:In recent years , some progress has been made in the study of contraceptive vaccine targeting epidydimal protease inhibitor ( Emitted ) .
( 2 ) the epitope crosslinking carrier protein can enhance immunogenicity , but the antibody specificity difference ;
( 3 ) Immunoadjuvant , such as Frederide ' s adjuvant , is commonly used in the experimental study of contraception vaccine , and its application in human body has a safety problem ;
Therefore , the key to solving this problem lies in the construction of a more secure and effective delivery system of contraceptive vaccine . This study is based on the dominant epitope of screening , designed to construct the self - assembly nano - peptide contraceptive vaccine of the multi - valence expressed antigen . In vitro , we study the immune response and anti - fertility effect of dendritic cell ( DC ) on the immune response and anti - fertility effect of the self - assembly polypeptide of E - 1 . The subject is divided into three parts .

Construction and Characterization of a Self - assembled Peptide E - 1

A new self - assembly nano - peptide was prepared by using synthetic peptide technique . The results showed that the purity of the fusion polypeptide E - 1 1 was greater than 90 % and the self - assembly was completed by adjusting the self - assembly condition .

Immune response of mouse bone marrow dendritic cells induced by self - assembly peptide of E - 1

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本文編號：2010360