本文選題：微囊藻毒素 + 支持細(xì)胞　； 參考：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2012年碩士論文

【摘要】：背景與目的 微囊藻毒素（mircrocystins, MCs）是由水體中藍(lán)藻類所產(chǎn)生的具有生物活性的單環(huán)七肽化合物，具有多種同分異構(gòu)體，MC-LR是微囊藻毒素中毒性最強(qiáng)的一種。目前藍(lán)藻毒素家族中唯有微囊藻毒素被世界衛(wèi)生組織（WHO）評(píng)估為國際性的健康危險(xiǎn)因素，它廣泛分布在淡水湖泊及池塘水庫中，能導(dǎo)致急性肝損傷并且是活躍的促腫瘤因子，已經(jīng)被國內(nèi)外廣泛研究。肝腎是其主要的靶器官，目前，MCs引起的生殖毒性的研究報(bào)道還很少，且主要是引起一些形態(tài)學(xué)及激素水平的改變。從細(xì)胞及基因水平研究MC-LR對(duì)雄性生殖器官的毒作用和機(jī)制的報(bào)道鮮有見到。本實(shí)驗(yàn)擬通過用MC-LR染毒原代SD大鼠睪丸支持細(xì)胞，探討MC-LR對(duì)大鼠睪丸支持細(xì)胞的毒性作用及對(duì)細(xì)胞即刻早期應(yīng)答基因c-fos、c-jun基因和蛋白表達(dá)的影響，闡明MC-LR對(duì)支持細(xì)胞毒性作用可能的原理及機(jī)制。 方法 在體外分離培養(yǎng)大鼠睪丸支持細(xì)胞，并用免疫熒光進(jìn)行鑒定。設(shè)置微囊藻毒素-LR藥物組（0.5nM，5nM，50nM，500nM）和對(duì)照組（0nM）作用于原代支持細(xì)胞。通過分別用MC-LR作用于原代支持細(xì)胞24h和48h后MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖的情況確定合適的作用時(shí)間和有效作用濃度；用FCM法測(cè)定細(xì)胞的凋亡；用RT-PCR法檢測(cè)c-jun、c-fos mRNA表達(dá)；用Western-blot方法檢測(cè)c-jun、c-fos的蛋白表達(dá)。從而從細(xì)胞和基因水平分析MC-LR對(duì)大鼠睪丸支持細(xì)胞毒性作用及對(duì)c-jun、c-fosmRNA及蛋白表達(dá)的影響。 結(jié)果 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在MTT法中，微囊藻毒素-LR作用于睪丸支持細(xì)胞24h和48h后分別檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：作用24h時(shí)，低劑量組（0.5nM，5nM）與對(duì)照組（0nM）相比其活性無明顯變化，而高劑量組（50nM，500nM）的活性明顯下降，增殖減慢，且變化具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；作用48h時(shí)，低劑量組（0.5nM，5nM）與對(duì)照組（0nM）相比其活性無明顯變化，而高劑量組（50nM，500nM）的活性顯著下降，變化具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義且500nM組差異有更顯著的變化(P0.01)。遂選用高劑量組和對(duì)照組作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的作用時(shí)間，48h為作用濃度進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)高劑量組微囊藻毒素-LR能夠引起明顯的細(xì)胞凋亡，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)，低劑量組變化則不顯著。RT-PCR法檢測(cè)結(jié)果顯示，，高劑量組的支持細(xì)胞出現(xiàn)c-jun、c-fos基因表達(dá)上調(diào)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Western-blot方法檢測(cè)到c-jun、c-fos蛋白表達(dá)上調(diào)，上調(diào)結(jié)果具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論 微囊藻作用于SD大鼠原代支持細(xì)胞后引起支持細(xì)胞的增殖抑制和細(xì)胞凋亡；刺激了c-fos和c-jun基因和蛋白的表達(dá)上調(diào)，推測(cè)c-fos和c-jun表達(dá)上調(diào)改變轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)通路而引起支持細(xì)胞增殖抑制和促進(jìn)凋亡，最終導(dǎo)致生殖發(fā)育損傷。
[Abstract]:Background and purpose Microcystins (MCss) are bioactive monocyclic heptopeptide compounds produced by cyanobacteria in water. MC-LR with multiple isomers is one of the most toxic microcystins. At present, only microcystin in the cyanobacterial toxin family is assessed as an international health risk factor by the World Health Organization (WHO). It is widely distributed in freshwater lakes and reservoirs and can cause acute liver injury and is an active tumor-promoting factor. Has been widely studied at home and abroad. Liver and kidney are the main target organs. There are few studies on the reproductive toxicity caused by MCs, and some morphological and hormone changes are mainly caused. Studies on the toxic effects and mechanisms of MC-LR on male reproductive organs at cell and gene level are rarely reported. The purpose of this study was to investigate the toxicity of MC-LR to rat testicular Sertoli cells and the effect of MC-LR on the expression of c-fos-c-jun gene and protein in rat testicular Sertoli cells. To elucidate the possible mechanism of the cytotoxicity of MC-LR to Sertoli cells. Method Rat testicular Sertoli cells were isolated and cultured in vitro and identified by immunofluorescence. The primary Sertoli cells were treated with the microcystin-LR drug group (0.5nM) and the control group (50nM). After treated with MC-LR for 24 h and 48 h, the proliferation of primary Sertoli cells was determined by MTT method. The appropriate time and effective concentration of cell proliferation were determined by FCM assay. The expression of c-junn c-fos mRNA was detected by RT-PCR method, and the expression of c-junn c-fos mRNA was detected by RT-PCR assay. The expression of c-junn c-fos was detected by Western-blot. The effects of MC-LR on the cytotoxicity of Sertoli cells and the expression of c-junn c-fos mRNA and protein in rat testis were analyzed at cell and gene levels. Result The results showed that in MTT assay, the activity of microcystin-LR in testicular Sertoli cells was not significantly changed compared with that of the control group at 24h and 48h after exposure to microcystin-LR. However, the activity of 50nM (500nM) in the high dose group was significantly decreased, the proliferation was slowed down, and the change was statistically significant (P0.05N). At 48h, the activity of the low dose group (0.5nM) did not change significantly compared with the control group (0nM), but the activity of the high dose group (50nM) decreased significantly, and the activity of the low-dose group decreased significantly compared with the control group (P0.05nM). The change was statistically significant and the difference in 500nM group was more significant (P 0.01). The high dose group and the control group were selected as the follow-up experiment for 48 hours. Flow cytometry (FCM) showed that microcystin-LR could induce apoptosis in high dose group (P 0.05), but not in low dose group (P 0.05). The expression of c-junn c-fos gene was up-regulated in Sertoli cells of high dose group, and the expression of c-junn c-fos protein was detected by Western-blot. Conclusion Microcystis can inhibit the proliferation and apoptosis of Sertoli cells after acting on primary Sertoli cells of SD rats, and stimulate the up-regulation of the expression of c-fos and c-jun genes and proteins. It is speculated that the up-regulation of c-fos and c-jun may induce the proliferation inhibition and apoptosis of Sertoli cells and eventually lead to reproductive development damage.
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R114

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本文編號(hào)：1952417