本文選題：微囊藻毒素-RR + 純化�。� 參考：《華中科技大學》2013年碩士論文

【摘要】：一、目的和意義 近年來,國內(nèi)藍藻水華的爆發(fā)頻度逐年增加。當藍藻死亡后，藻細胞破裂釋放大量的藻類毒素，其中以微囊藻毒素的存在最為普遍，且與人類健康的關(guān)系最為密切，成為目前研究最多的一類藻類毒素。其毒理學、免疫學以及降解和去除等成為研究的熱點，需要大量微囊藻毒素純品。但因其價格昂貴且主要依靠進口，成為困擾研究人員進一步深入開展上述研究的瓶頸。 本文旨在開展微囊藻毒素-RR（MC-RR）純化以及急性毒性的研究，通過選擇與優(yōu)化提取方法、固相萃取、Sephadex LH-20凝膠色譜層析各種參數(shù)，獲得純度超過90%的MC-RR。再用純化的MC-RR作為受試物經(jīng)腹腔注射和經(jīng)口兩種不同的途徑，測定LD50值，初步評價MC-RR對機體的急性毒性效應特征、靶器官、劑量-反應關(guān)系，為今后自主提取、純化、收獲藻毒素純品提供一套較為成熟的方法，并為其他毒性實驗的劑量設(shè)計和觀察指標選擇提供參考依據(jù)。 二、方法 1.化學提取與鑒定以野外采集的藍藻水華為原料，通過比較反復凍融、水浴法和70%甲醇細胞破碎法提取效率，確定70%甲醇提取法為最優(yōu)方法后，對后者提取重復次數(shù)，每次提取時間及提取溫度等參數(shù)進行優(yōu)化。獲得的粗提液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除甲醇后，經(jīng)固相萃取初步純化和濃縮，，上樣至Sephadex LH-20凝膠層析柱，以甲醇為流動相，用自動部分收集器收集洗脫液，紫外分光光度計測定每管洗脫液在238nm的吸收值。以A238為縱坐標，以管編號為橫坐標繪制洗脫曲線。對上樣量，洗脫液流速進行優(yōu)化，獲得最優(yōu)洗脫條件。用高效液相色譜對峰值組分進行鑒定，并同時利用紫外分光光度計對毒素光譜特征進行鑒定。 2.生物毒性鑒定采用改進寇氏法計算MC-RR經(jīng)腹腔注射小鼠LD50值。根據(jù)預實驗的結(jié)果，分為400μg/kg、282.84μg/kg、200μg/kg、141.42μg/kg、100μg/kg五個劑量組，對照組為生理鹽水組，每組10只昆明小鼠，雌雄各半。染毒后觀察急性中毒行為表現(xiàn)，記錄小鼠死亡數(shù)及死亡時間，并對死亡小鼠及時取心肝腎以計算臟器系數(shù)以及進行組織病理學檢查。用序貫法測MC-RR經(jīng)口的LD50值，并根據(jù)測定的LD50值染毒，測定小鼠在其開始發(fā)生中毒反應時間和平均死亡時間這兩個時點的血清酶學、肝臟臟器指數(shù)以及病理組織學的改變。 三、結(jié)果 1.用70%的甲醇溶液溶解35g藻漿，經(jīng)離心等系列處理，得粗提液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除甲醇；經(jīng)HLB柱固相萃取后，7.5mL洗脫液含4.92mg MC-RR和0.53mg微囊藻毒素-LR(MC-LR)，然后將其濃縮至2mL；再用Sephadex LH-20凝膠過濾層析進一步純化，通過測定流出組分在238nm處的吸光度值，確定MC-RR在第一個洗脫峰，最終獲得3.65mg樣品純度超過90%的MC-RR，產(chǎn)品得率為74.1%。其吸收光譜在238nm處有特征吸收。 2.小鼠經(jīng)腹腔注射染毒LD50=192.75μg/kg，95%的置信區(qū)間為176.59~206.89μg/kg。400μg/kg、282.84μg/kg、200μg/kg、141.42μg/kg、100μg/kg五個劑量組小鼠死亡率分別為10/10,9/10,6/10,1/10,0/10。隨著劑量增加，肝臟臟器系數(shù)顯著增加，組織病理學肝細胞壞死、肝竇充血逐漸加重。經(jīng)口染毒LD50為12.10mg/kg，95%的置信區(qū)間為10.75~13.45mg/kg。以LD50劑量給小鼠染毒后，約45min后開始有中毒反應，平均死亡時間為4h。與對照相比，血清中ALT、AST、ALP及LDH的水平在45min時明顯上升，4h后進一步上升。肝臟臟器系數(shù)與血清酶學的變化一致，而心臟和腎臟臟器系數(shù)未見明顯改變。組織病理學變化顯示染毒45min后，肝細胞呈點狀壞死和肝臟組織少量充血，4h后肝細胞大面積壞死，肝竇大面積充血。 四、結(jié)論 以野外收集的水華藍藻為原料，采用75%的甲醇溶液提取，經(jīng)過固相萃取初步濃縮純化后，再通過Sephadex LH-20凝膠層析，獲得純度超過90%的MC-RR。MC-RR具有明顯的肝毒性，在急性毒性中未觀察到腎臟和心臟毒性。
[Abstract]:I . Purpose and significance

In recent years , the outbreak frequency of blue - green algae bloom in China increased year by year . When the blue algae died , the algae cells burst and released a large amount of algae toxin , which was the most common type of algae toxin in the present study .

The purpose of this study was to study the purification and acute toxicity of microcystin - RR ( MC - RR ) . By selecting and optimizing extraction method , solid phase extraction and Sephadex LH - 20 gel chromatography , MC - RR was obtained . The acute toxicity effect , target organ , dose - response relationship between MC - RR and MC - RR were determined .

II . Methodology

1 . The raw materials of blue - green algae water collected in the wild were extracted and identified by chemical extraction and identification . After the extraction of methanol with 70 % methanol was carried out by means of comparison of repeated freeze - thaw , water - bath method and 70 % methanol - cell crushing method , the parameters such as the number of repetitions , the time of each extraction and the extraction temperature were optimized .

2 . The LD50 value of MC - RR by intraperitoneal injection of MC - RR was calculated by the improved method . According to the results of pre - experiment , the mice were divided into four groups : 400 渭g / kg , 282.84 渭g / kg , 200渭g / kg , 141.42渭g / kg , 100渭g / kg , and control group were physiological saline group .

III . Results

1 . dissolving 35g of algae slurry with 70 % methanol solution , centrifuging to obtain crude extract , and rotary evaporation to remove methanol ;
After solid - phase extraction with HLB column , 7.5 mL of eluent contained 4.92 mg of MC - RR and 0.53 mg of microcystin - LR ( MC - LR ) , and then concentrated to 2 mL ;
After further purification by Sephadex LH - 20 gel filtration chromatography , the MC - RR was determined by measuring the absorbance of the effluent component at 238 nm , the MC - RR was determined at the first elution peak , finally 3.65 mg of MC - RR was obtained with a purity of over 90 % , and the yield of the product was 74.1 % . Its absorption spectrum was characterized by absorption at 238 nm .

2 . The LD50 = 192.75渭g / kg , 95 % confidence interval was 176.59 - 206.89渭g / kg . 40渭g / kg , 282.84 渭g / kg , 200渭g / kg , 141.42渭g / kg , 100 渭g / kg , respectively .

IV . Conclusions

The MC - RR . MC - RR with purity of more than 90 % was obtained by gel chromatography on Sephadex LH - 20 after preliminary concentration and purification by Sephadex LH - 20 gel chromatography . The renal and cardiotoxicity were not observed in acute toxicity .
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R114

【參考文獻】

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本文編號：1901539