三氧化二砷導致人體細胞中組蛋白H4K16乙酰化水平下調(diào)的作用機制研究
發(fā)布時間：2021-03-31 17:39
表觀遺傳機制,如組蛋白翻譯后修飾,能夠可遺傳地調(diào)控大多數(shù)與細胞生命進程相關基因的表達。外界環(huán)境對細胞的刺激,會改變細胞內(nèi)組蛋白翻譯后修飾,引起染色質(zhì)結構變化,從而影響基因的表達。砷化合物(三氧化二砷)是一類公認的致癌物,也是飲用水的主要污染物之一,三氧化二砷引起的飲用水污染是世界性環(huán)境問題。而另一方面,三氧化二砷還是臨床治療急性早幼粒細胞性白血病(APL)最有效的藥物之一,但如何降低三氧化二砷對人體的毒副作用一直是一個難題。越來越多的證據(jù)表明砷化合物介導的表觀遺傳調(diào)控與其毒理和藥理作用密切相關。有文章報道,三氧化二砷能夠引起UROtsa細胞內(nèi)組蛋白H4K16位賴氨酸乙�；�(H4K16ac)水平下降,但此過程中三氧化二砷的具體作用機制還不明確,其是否作用于催化H4K16ac的組蛋白乙酰轉移酶h MOF(MYST1/KAT8,human male absent on first)還不為人所知。本論文對這一機制進行了深入研究,通過一系列生化實驗及敲低/過表達h MOF的細胞實驗,證實三氧化二砷調(diào)控的細胞內(nèi)H4K16ac水平下降,很大程度是由于砷原子與組蛋白乙酰轉移酶(HAT)h MOF之間的直接結合所導致的h MOF酶活性缺失造成的。本論文的實驗結果表明,三氧化二砷處理He La細胞或HEK293T細胞24、48和72h,均能觀察到組蛋白H4K16ac水平隨三氧化二砷濃度的升高而降低,而組h MOF的轉錄和表達水平并未發(fā)生明顯變化。本文通過體外組蛋白乙酰轉移酶活性檢測(HAT assay)證明,三氧化二砷直接抑制了h MOF的酶活性。為了探明二者的相互作用機制,我們用氨基苯基氧化砷(PAPAO)與瓊脂糖凝膠樹脂交聯(lián),構建出As-親和樹脂(As-activated agarose),利用As-親和沉淀實驗證明砷原子能直接結合h MOF。同時,采用MAIDI-TOF質(zhì)譜檢測和紫外光譜吸收實驗證明,砷原子直接結合在h MOF鋅指結構的C2HC部位。細胞實驗表明,過表達h MOF不僅降低了三氧化二砷對HEK293T細胞的毒性,同時還有效地逆轉了三氧化二砷引起的細胞內(nèi)H4K16ac水平降低。而且在He La細胞中敲低h MOF,可以增加三氧化二砷引起的細胞壞死和凋亡。實驗證明,三氧化二砷能夠上調(diào)HEK293T細胞中去乙酰轉移酶HDAC4的表達,但用si RNA敲低HDAC4并不影響H4K16ac的乙�；�,也無法抑制三氧化二砷導致的H4K16ac水平下降,這些結果表明HDAC4可能不直接參與組蛋白H4K16的乙酰化。通過在HEK293T細胞中的染色質(zhì)免疫沉淀(CHIP)檢測,我們證實三氧化二砷可以阻斷h MOF在HDAC4轉錄起始區(qū)域(-1890、-476和+588 kb位點)的募集,并上調(diào)HDAC4的轉錄和表達。綜上所述:本文首次證明三氧化二砷直接結合在組蛋白乙酰轉移酶h MOF鋅指結構的C2HC部位,抑制h MOF的乙酰轉移酶活性,從而下調(diào)細胞內(nèi)H4K16ac水平,并導致HDAC4表達水平升高。同時,h MOF催化的組蛋白H4K16ac修飾,能夠提高人體細胞對三氧化二砷毒性的抵抗力。本文關于三氧化二砷對h MOF以及H4K16乙酰化修飾的表觀遺傳調(diào)控機制的研究,為今后闡明砷化合物的毒理和藥理作用機理提供了新的研究方向。
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R114
本文編號：1890264
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R114
文章目錄
摘要
Abstract
縮略詞
第1章 緒論
1.1 表觀遺傳學與組蛋白修飾
1.1.1 表觀遺傳學概述
1.1.2 組蛋白修飾
1.2 組蛋白乙酰轉移酶hMOF與組蛋白H4K16ac
1.2.1 組蛋白乙酰轉移酶hMOF
1.2.2 組蛋白去乙酰轉移酶HDACs
1.2.3 組蛋白H4K16ac
1.3 三氧化二砷概述
1.3.1 三氧化二砷的危害及應用
1.3.2 三氧化二砷的作用機制
1.3.3 三氧化二砷與表觀遺傳修飾
1.4 立題依據(jù)與研究意義
1.4.1 立題依據(jù)
1.4.2 研究意義
第2章 三氧化二砷對組蛋白H4乙�；揎椉癶MOF表達和轉錄水平的調(diào)控作用
2.1 引言
2.2 材料與儀器
2.2.1 細胞
2.2.2 抗體
2.2.3 RT‐PCR引物
2.2.4 實驗試劑
2.2.5 實驗儀器
2.3 試驗方法
2.3.1 三氧化二砷（As2O3）儲液的配制
2.3.2 細胞培養(yǎng)與三氧化二砷處理
2.3.3 Western blot檢測
2.3.4 Western blot數(shù)據(jù)分析
2.3.5 免疫熒光染色（Immunofluorescence Staining）
2.3.6 RNA提取
2.3.7 反轉錄
2.3.8 Realtime PCR反應
2.3.9 hMOF螢光素酶報告基因檢測
2.4 實驗結果
2.4.2 三氧化二砷對組蛋白H4乙�；揎椀恼{(diào)控
2.4.3 三氧化二砷不影響hMOF的轉錄水平
2.4.4 三氧化二砷不影響細胞中hMOF的蛋白表達水平
2.5 小結
第3章 三氧化二砷對hMOF乙酰轉移酶活性的調(diào)控機制研究
3.1 引言
3.2 材料與儀器
3.2.1 細胞
3.2.2 抗體
3.2.3 重組質(zhì)粒
3.2.4 合成肽
3.2.5 實驗試劑
3.2.6 實驗儀器
3.3 試驗方法
3.3.1 HA‐h MOF重組蛋白在Sf21昆蟲細胞中的表達純化
3.3.2 體外HAT活性檢測（HAT assay）
3.3.3 As‐immobilized agarose的構建
3.3.4 Western blot檢測
3.3.5 Western blot數(shù)據(jù)分析
3.3.6 Arsenic‐immobilized agarose親和沉淀實驗
3.3.7 hMOF合成肽的體外合成
3.3.8 MALDI‐TOF MS
3.3.9 紫外吸光度檢測
3.3.10 hMOF三結構維模型的構建
3.4 實驗結果
3.4.1 三氧化二砷抑制hMOF的乙酰轉移酶活性
3.4.2 三氧化二砷與hMOF直接相互結合
3.4.3 三氧化二砷與hMOF結合位點的確認
3.4.4 砷原子與hMOF結合的三維結構模擬
3.5 小結
第4章 三氧化二砷對組蛋白去乙酰轉移酶HDAC4的調(diào)控機制研究
4.1 引言
4.1.1 染色質(zhì)免疫沉淀（CHIP）
4.2 材料與儀器
4.2.1 細胞株
4.2.2 抗體
4.2.3 siRNA
4.2.4 RT‐PCR引物
4.2.5 HDAC4 CHIP引物
4.2.6 實驗試劑
4.2.7 實驗儀器
4.3 試驗方法
4.3.1 細胞培養(yǎng)及三氧化二砷處理
4.3.2 Western blot檢測
4.3.3 Western blot數(shù)據(jù)分析
4.3.4 免疫熒光染色
4.3.5 過表達hMOF
4.3.6 si RNA敲低hMOF及HDAC4
4.3.7 DNA芯片數(shù)據(jù)分析
4.3.8 hMOF在HDAC4上的CHIP
4.4 實驗結果
4.4.1 三氧化二砷對HDACs蛋白表達水平的影響
4.4.2 敲低hMOF上調(diào)HDAC4的轉錄和表達
4.4.3 HDAC4不調(diào)控細胞內(nèi)H4K16ac水平
4.4.4 三氧化二砷阻斷hMOF在HDAC4轉錄起始位點的募集
4.5 小結
第5章h MOF降低三氧化二砷的細胞毒性
5.1 引言
5.1.1 線粒體膜電位檢測（JC‐1 染色）
5.2 材料與儀器
5.2.1 細胞
5.2.2 抗體
5.2.3 重組質(zhì)粒
5.2.4 siRNA
5.2.5 實驗試劑
5.2.6 實驗儀器
5.3 試驗方法
5.3.1 hMOF在HEK293T細胞中的過表達
5.3.2 Lipofectamine RNAiMAX轉染siRNA
5.3.3 Western blot檢測
5.3.4 Western blot數(shù)據(jù)分析
5.3.5 MTT實驗
5.3.6 流式細胞分析
5.3.7 JC‐1 染色
5.4 實驗結果
5.4.1 過表達hMOF逆轉三氧化二砷對H4K16ac的下調(diào)
5.4.2 過表達hMOF抑制三氧化二砷上調(diào)HDAC4
5.4.3 過表達hMOF增強細胞對三氧化二砷的抗性
5.4.4 敲低hMOF增強HeLa細胞對三氧化二砷敏感性
5.5 小結
第6章 結論與展望
6.1 結論
6.2 后續(xù)展望
參考文獻
作者簡介及在學期間所取得的科研成果
致謝
【相似文獻】
相關博士學位論文 前1條
1 劉達;三氧化二砷導致人體細胞中組蛋白H4K16乙酰化水平下調(diào)的作用機制研究[D];吉林大學;2015年
本文編號：1890264
本文鏈接：http://sikaile.net/yixuelunwen/yufangyixuelunwen/1890264.html
最近更新
教材專著
