本文選題：左卡尼汀 + HL7702細(xì)胞��； 參考：《青島大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：目的:左卡尼汀(L-carnitine,LC)又稱左旋肉堿,是人體必需的一種類維生素營(yíng)養(yǎng)素,在動(dòng)物性食品中含量豐富。臨床研究發(fā)現(xiàn),肝病病人體內(nèi)LC缺乏,外源性補(bǔ)充LC對(duì)多種肝病具有輔助治療作用。實(shí)驗(yàn)研究也證實(shí),LC對(duì)多種因素誘導(dǎo)的肝損傷具有保護(hù)作用。目前,LC保肝作用分子機(jī)制尚未闡明,本課題將建立過氧化氫(hydrogen peroxide,H_2O_2)誘導(dǎo)的人HL7702肝細(xì)胞損傷模型,從抗氧化、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子(Nrf_2、MAPK、PI3K/Akt、PPAR-α、AMPK、GSK-3β)的角度探究LC保護(hù)肝細(xì)胞損傷的分子機(jī)制。方法:1.LC對(duì)H_2O_2損傷HL7702肝細(xì)胞活性及抗氧化能力的影響:實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為:正常對(duì)照組、H_2O_2損傷組、LC組(0.1、0.5、1.0 mmol/L)。分別以MTT、乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase,LDH)法檢測(cè)細(xì)胞活性;酶化學(xué)法測(cè)定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過氧化氫酶(catalase,CAT)活性及丙二醛(MDA)含量;以2,7-二氯氫化熒光素二酯(DCFH-DA)為熒光探針,流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平。2.LC對(duì)核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf_2)/血紅素加氧酶1(heme oxygenase,HO-1)通路的調(diào)控:Western blot技術(shù)檢測(cè)Nrf_2、HO-1蛋白的經(jīng)時(shí)表達(dá);免疫熒光染色法確定Nrf_2的核轉(zhuǎn)位;凝膠遷移實(shí)驗(yàn)(Electrophoretic Mobility Shift Assay,EMSA)評(píng)價(jià)Nrf_2-DNA結(jié)合活性;Nrf_2 si RNA技術(shù)分析Nrf_2與HO-1的級(jí)聯(lián)關(guān)系及Nrf_2在LC保護(hù)肝細(xì)胞損傷中的作用。3.LC對(duì)絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)、磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B,PI3K/Akt)通路的調(diào)控:Western blot測(cè)定H_2O_2損傷HL7702細(xì)胞MAPK、PI3K/Akt通路的變化及LC的影響;應(yīng)用相應(yīng)抑制劑,分析JNK、ERK、p38MAPK在H_2O_2損傷HL7702細(xì)胞中的作用;采用Akt抑制劑IV評(píng)價(jià)Akt是否參與了LC的保護(hù)作用以及LC對(duì)Nrf_2/HO-1通路的激活作用。4.LC對(duì)H_2O_2損傷HL7702細(xì)胞脂肪酸代謝、能量代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響:Western blot技術(shù)檢測(cè)過氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferator-activated receptors-α,PPAR-α)的經(jīng)時(shí)表達(dá),并從m RNA和蛋白水平測(cè)定LC對(duì)PPAR-α及其下游基因肉毒堿棕櫚酸轉(zhuǎn)移酶1(CPT1)、脂肪酰基輔酶A氧化酶(ACOX)的影響;分析PPAR-α在LC保護(hù)細(xì)胞損傷中的作用及與SOD、CAT的相關(guān)性;測(cè)定H_2O_2損傷HL7702細(xì)胞腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)、糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)的經(jīng)時(shí)變化特點(diǎn)及LC的調(diào)節(jié)作用;應(yīng)用相應(yīng)抑制劑分析AMPK在LC保護(hù)細(xì)胞損傷中的作用以及PI3K/Akt、AMPK與GSK-3β的級(jí)聯(lián)關(guān)系。結(jié)果:1.以0.3 mmol/L H_2O_2損傷HL7702細(xì)胞12 h為病理模型。0.1?1.0 mmol/L LC劑量依賴性抑制了H_2O_2引起的細(xì)胞活性降低及LDH釋放(P0.05,P0.01)。與正常對(duì)照組相比,H_2O_2損傷組細(xì)胞SOD和CAT蛋白表達(dá)水平顯著下降(P0.01),SOD和CAT活性分別下降了30.07%和38.26%,ROS及MDA水平顯著增加,分別為對(duì)照組的3.8倍和1.7倍;LC能夠抑制H_2O_2引起的SOD、CAT蛋白表達(dá)及活性的降低,以及ROS、MDA水平的增加(P0.05,P0.01)。2.經(jīng)時(shí)表達(dá)分析發(fā)現(xiàn),H_2O_2損傷1 h細(xì)胞核Nrf_2表達(dá)迅速升高,隨后逐漸降低,HO-1表達(dá)呈逐漸上升趨勢(shì);LC預(yù)孵育對(duì)H_2O_2誘導(dǎo)的Nrf_2核轉(zhuǎn)位、Nrf_2-DNA結(jié)合活性升高及HO-1蛋白表達(dá)增加均有明顯促進(jìn)作用(P0.05);Nrf_2 si RNA技術(shù)將細(xì)胞Nrf_2沉默后,抑制了LC的保護(hù)作用及增強(qiáng)HO-1表達(dá)的作用。3.H_2O_2損傷后p-JNK、p-ERK、p-p38MAPK表達(dá)均迅速升高,p-Akt表達(dá)呈先升高后降低的雙相改變;LC能有效抑制H_2O_2引起的p-JNK、p-p38MAPK表達(dá)升高(P0.05,P0.01),但對(duì)p-ERK表達(dá)無明顯影響;LC既能增強(qiáng)損傷1 h時(shí)p-Akt的升高(P0.01),又能抑制損傷12 h時(shí)p-Akt的降低(P0.01)。除ERK抑制劑外,JNK、p38MAPK、Akt抑制劑均能有效抑制H_2O_2引起細(xì)胞活性降低(P0.05),且Akt抑制劑也抑制了LC對(duì)Nrf_2/HO-1通路的激活作用。4.本研究首次發(fā)現(xiàn),H_2O_2損傷肝細(xì)胞時(shí)PPAR-α蛋白表達(dá)逐漸降低;LC預(yù)孵育能增強(qiáng)PPAR-α及其下游基因CPT1、ACOX的表達(dá)(P0.05,P0.01);PPAR-α激動(dòng)劑能有效抑制H_2O_2引起的SOD、CAT活性及細(xì)胞活性的降低;PPAR-α抑制劑阻斷了LC增強(qiáng)SOD、CAT表達(dá)及細(xì)胞活性的作用。p-AMPK、p-GSK-3β表達(dá)在H_2O_2損傷后逐漸降低,LC對(duì)其均有明顯抑制作用(P0.01),且能抑制AMPK上游激酶肝激酶B1(Liver kinase B1,LKB1)及下游底物乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-Co A carboxylase,ACC)的活性降低(P0.05,P0.01)。AMPK抑制劑阻斷了LC增強(qiáng)細(xì)胞活性及p-GSK-3β表達(dá)的作用,Akt抑制劑對(duì)LC增強(qiáng)p-GSK-3β表達(dá)的作用無影響。結(jié)論:1.LC保護(hù)H_2O_2損傷HL7702細(xì)胞的作用與升高SOD、CAT活性,降低ROS及MDA水平有關(guān)。2.LC通過激活A(yù)kt/Nrf_2/HO-1通路保護(hù)H_2O_2誘導(dǎo)的HL7702細(xì)胞損傷。3.JNK、p38MAPK的激活參與H_2O_2損傷HL7702細(xì)胞,LC的保護(hù)作用與抑制JNK、p38MAPK的激活有關(guān);ERK未參與H_2O_2的損傷作用,且與LC的保護(hù)作用無關(guān)。4.PPAR-α參與了H_2O_2誘導(dǎo)的HL7702細(xì)胞損傷。LC通過增加PPAR-α及其下游基因CPT1、ACOX表達(dá),激活LKB1/AMPK/ACC通路,抑制GSK-3β活性而保護(hù)H_2O_2誘導(dǎo)的HL7702細(xì)胞損傷,且PPAR-α表達(dá)增加與SOD、CAT的表達(dá)增加有關(guān)。
[Abstract]:Objective : L - carnitine ( LC ) , also known as L - carnitine , is a kind of vitamin nutrient necessary for human body and is rich in animal food . )娉曟嫻嬬粏鑳?yōu)娲绘�，

本文編號(hào)：1884658