發(fā)布時(shí)間：2018-05-05 18:13

  本文選題：γH2AX + Chk2��； 參考：《南華大學(xué)》2012年碩士論文

【摘要】：目的： 觀察細(xì)胞周期G2/M期γH2AX焦點(diǎn)的形成，探討與有絲分裂進(jìn)程相關(guān)的H2AX磷酸化的規(guī)律特征，分析γH2AX作為DNA DSB損傷和修復(fù)分子標(biāo)志物的合理性；建立Chk2穩(wěn)定過(guò)表達(dá)和沉默的細(xì)胞系，研究其對(duì)有絲分裂進(jìn)程、電離輻射誘導(dǎo)的G2/M期阻滯、細(xì)胞凋亡和腫瘤治療藥物敏感性的影響，從而為尋找腫瘤放療和化療的新靶點(diǎn)提供思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 采用胸腺嘧啶雙阻滯結(jié)合噻氨酯噠唑的后續(xù)處理，將HeLa細(xì)胞同步于有絲分裂的前中期，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期、western blotting和激光共聚焦免疫熒光法，觀察γH2AX蛋白水平表達(dá)和γH2AX焦點(diǎn)的形成。利用PCR法將外源基因?qū)胝婧吮磉_(dá)載體，利用Lipofectamin2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，經(jīng)G418或Hygromycin抗性篩選獲得穩(wěn)定過(guò)表達(dá)和沉默的HeLa細(xì)胞系，采用quantitativeReal-Time PCR和western blotting鑒定構(gòu)建的Chk2穩(wěn)定過(guò)表達(dá)和沉默的HeLa細(xì)胞系，利用胸腺嘧啶雙阻滯釋放法結(jié)合流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞系細(xì)胞周期的變化；應(yīng)用細(xì)胞生長(zhǎng)曲線檢測(cè)Chk2沉默對(duì)HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)速率的影響；AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞儀分析電離輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡情況；westernblotting檢測(cè)電離輻射處理下Chk2沉默細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞中p53和pig3的表達(dá)變化，MTT法檢測(cè)細(xì)胞對(duì)腫瘤治療藥物紫杉醇敏感性的影響；Time lapse法實(shí)時(shí)觀察DNA-PKcs沉默或活性抑制的HeLa細(xì)胞有絲分裂情況。 結(jié)果： 1、HeLa細(xì)胞進(jìn)入G2/M期和有絲分裂過(guò)程中，γH2AX水平顯著增加；在無(wú)DNA DSB發(fā)生的情況下，部分M期細(xì)胞中也存在大量的γH2AX焦點(diǎn)。隨著細(xì)胞完成有絲分裂從M期退出再進(jìn)入G1期，，γH2AX的表達(dá)水平逐漸降低。這種γH2AX表達(dá)變化特征幾乎與G2/M期密切關(guān)聯(lián)的PLK1和Cyclin B1的表達(dá)規(guī)律相類(lèi)似。 2、在4Gy大劑量照射下，HeLa細(xì)胞于照后8h和12h出現(xiàn)明顯的G2/M期阻滯，γH2AX焦點(diǎn)數(shù)在照后1h達(dá)高峰，隨后降低，照后8h又上升出現(xiàn)了第二個(gè)峰值。與之不同的是，在1Gy低劑量照射下，細(xì)胞的G2/M期阻滯微弱，γH2AX焦點(diǎn)數(shù)在照后0.5h最高，隨后下降，且無(wú)反彈，符合DNA DSB的修復(fù)動(dòng)力學(xué)特征。 3、Western blotting和qRT-PCR結(jié)果顯示Chk2穩(wěn)定過(guò)表達(dá)和沉默的HeLa細(xì)胞系構(gòu)建成功；流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示Chk2過(guò)表達(dá)野生型(WT)和持續(xù)激活型(T68D) HeLa細(xì)胞G2/M期延長(zhǎng)，而過(guò)表達(dá)持續(xù)抑制型(T68A) HeLa細(xì)胞對(duì)其周期無(wú)明顯影響；Chk2過(guò)表達(dá)提高了電離輻射引起的HeLa細(xì)胞G2/M期阻滯。 4、Chk2沉默HeLa細(xì)胞細(xì)胞周期進(jìn)程加快，Chk2沉默導(dǎo)致HeLa細(xì)胞增殖速度加快，降低了電離輻射引起的G2/M期阻滯，引起電離輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率降低以及p53和pig3蛋白表達(dá)水平的下調(diào)，且對(duì)腫瘤治療藥物紫杉醇的敏感性降低。 5、在有絲分裂期，Chk2pT68和γH2AX高表達(dá)，DNA-PKcs活性抑制導(dǎo)致Chk2pT68和γH2AX表達(dá)水平下降，Chk2沉默同樣導(dǎo)致γH2AX表達(dá)水平下降。 6、DNA-PKcs沉默或活性抑制的HeLa細(xì)胞有絲分裂異常比例增加，包括出現(xiàn)較多有絲分裂中期的misalign chromosome、后期的lagging chromosome以及有絲分裂災(zāi)變死亡等有絲分裂異�，F(xiàn)象。 結(jié)論： 1、將γH2AX作為判斷DNA DSB發(fā)生和修復(fù)效率的分子標(biāo)志物時(shí)，需要綜合考慮細(xì)胞周期變化的影響因素；γH2AX適合作為1Gy以下低劑量照射的DNADSB的分子標(biāo)志物； 2、成功構(gòu)建了穩(wěn)定過(guò)表達(dá)Chk2野生型和突變型的HeLa細(xì)胞系以及穩(wěn)定沉默Chk2的HeLa細(xì)胞系；Chk2影響細(xì)胞周期G2/M期進(jìn)程，且依賴(lài)于Thr68位點(diǎn)的磷酸化；Chk2調(diào)控p53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，Chk2沉默導(dǎo)致細(xì)胞凋亡率降低；Chk2沉默導(dǎo)致HeLa細(xì)胞對(duì)靶向細(xì)胞周期的抗腫瘤藥物紫杉醇的敏感性降低。 3、Chk2調(diào)控有絲分裂進(jìn)程的上游分子主要是DNA-PKcs，有絲分裂期H2AX的磷酸化主要受DNA-PKcs-Chk2信號(hào)通路調(diào)控。
[Abstract]:Objective:
Observe the formation of G2/M phase gamma H2AX focal point in cell cycle, explore the regularity of H2AX phosphorylation related to the mitosis process, analyze the rationality of gamma H2AX as a DNA DSB damage and repair molecular marker, establish a Chk2 stable over expression and silent cell line, to study the process of mitosis and the G2/M phase arrest induced by ionizing radiation. The effects of apoptosis and drug sensitivity on tumor therapy provide ideas and experimental evidence for finding new targets for tumor radiotherapy and chemotherapy.
Method錛

本文編號(hào)：1848771