本文選題：N-乙�；�-絲氨酰-天冬氨酰-賴氨酰-脯氨酸 + 熱休克蛋白27　； 參考：《河北醫(yī)科大學》2014年博士論文

【摘要】：目的：矽肺是一種職業(yè)性疾病。在我國，由于經(jīng)濟的較快發(fā)展，促進了工業(yè)化進程的加快。而塵肺病的發(fā)病率也在逐年升高。近年來塵肺病的發(fā)病人數(shù)以每年超過2萬例的速度增長。截至2012年底，全國累計報告職業(yè)病人數(shù)為807269例，其中，塵肺病為727148例，占到職業(yè)病總?cè)藬?shù)的90%。在這些患者中一半以上為矽肺病。因此，在我國矽肺是最多見、最嚴重的塵肺病。矽塵作為潛在的致纖維化因子，能促進支氣管/肺泡上皮細胞凋亡，并可介導支氣/肺泡上皮細胞向肌成纖維細胞的轉(zhuǎn)化，即上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變。目前認為上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變是矽肺病發(fā)生發(fā)展的一個重要環(huán)節(jié)。 我們前期應(yīng)用蛋白質(zhì)組學技術(shù)在矽肺大鼠肺組織中篩選出33個有意義的差異性蛋白，其中熱休克蛋白27是比較典型的差異蛋白之一。HSP27作為一個小分子量熱休克蛋白，在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變過程中，可通過調(diào)節(jié)核轉(zhuǎn)錄因子SNAI1的表達而參與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變的過程。 N-乙�；�-絲氨酰-天冬氨酰-賴氨酰-脯氨酸（N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline, Ac-SDKP）是一種具有抗器官纖維化功能的短肽，我們和其他課題組發(fā)現(xiàn)Ac-SDKP具有抑制器官纖維化（包括心、腎、肺）的功能。近期我們報道了Ac-SDKP能夠通過抑制TGF-β及其受體誘導的肺成纖維細胞向肌成纖維細胞的分化，進而抑制矽肺纖維化的發(fā)生、發(fā)展，而發(fā)揮其拮抗矽肺纖維化的作用。然而，Ac-SDKP能夠能夠通過調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)的轉(zhuǎn)變調(diào)控矽肺纖維化的發(fā)生與發(fā)展？尚無文獻報道。 本研究擬采用體內(nèi)矽肺動物模型結(jié)合體外細胞培養(yǎng)及其體外細胞轉(zhuǎn)染等方法，研究與探討Ac-SDKP能否通過對HSP27表達的調(diào)節(jié)，調(diào)控支氣管/肺泡上皮細胞向肌成纖維細胞的轉(zhuǎn)化，進而阻抑矽肺纖維化的形成與進展。進一步揭示Ac-SDKP抗矽肺纖維化作用的分子機制，為將其開發(fā)為一種抗矽肺纖維化的新藥提供一些重要的理論與實驗依據(jù)，并對其它器官（肝、腎、心血管）纖維化疾病的防治研究提供一些重要的信息。 方法：采用支氣管一次性灌注二氧化硅（SiO2）粉塵制作大鼠矽肺模型，動物被分為：1）對照4周組；2）矽肺4周組；3）Ac-SDKP單獨給藥4周組；4）對照8周組；5）矽肺8周組；6）Ac-SDKP單獨給藥8周組；7）Ac-SDKP后處理組（抗纖維化治療組）；6）Ac-SDKP前處理組（預(yù)防治療組）。體外培養(yǎng)人肺泡Ⅱ型上皮細胞，并分為：1）對照組；2）TGF-β1誘導組；3）Ac-SDKP干預(yù)組（TGF-β1+Ac-SDKP）；4）Ac-SDKP單獨給藥組。采用免疫組織化學染色、免疫細胞化學染色、Western blot或Realtime PCR等方法檢測HSP27、磷酸化HSP27、SNAI1、SNAI2、上皮組織標記物CK、SP-A、間質(zhì)組織標記物α-SMA、vimentin、I型和III型膠原蛋白的表達。采用激光共聚焦顯微鏡檢測矽肺模型大鼠SP-A與α-SMA、pHSP27與α-SMA的共定位表達；檢測人肺泡Ⅱ型上皮細胞各組別HSP27與SNAI1、HSP27與SNAI2的共定位表達。 采用體外細胞轉(zhuǎn)染的方法將特異性HSP27基因片段轉(zhuǎn)染人肺泡Ⅱ型上皮細胞，實驗分為7組，1)空質(zhì)粒對照組；2）空質(zhì)粒+TGF-β1組；3）HSP27干擾質(zhì)粒+TGF-β1組；4）空質(zhì)粒+TGF-β1+Ac-SDKP組；采用Western blot方法檢測E-cad、α-SMA、HSP27、磷酸化HSP27、SNAI1、SNAI2、I型III型膠原蛋白的表達。 結(jié)果： 1Ac-SDKP對矽肺大鼠肺組織中間質(zhì)組織標志蛋白（α-SMA、Vimentin）和上皮組織標志蛋白（E-cad、SP-A）表達的調(diào)節(jié)作用 免疫組織化學染色結(jié)果顯示，在正常對照組α-SMA、Vimentin僅在大鼠血管和氣管平滑肌細胞中陽性表達，而在矽肺大鼠間質(zhì)纖維化區(qū)域和矽結(jié)節(jié)中可見較多的α-SMA和Vimentin陽性表達的細胞。而Ac-SDKP治療給藥組（包括前處理與后處理組）α-SMA和Vimentin陽性表達的細胞數(shù)量和范圍均明顯減少。 激光共聚焦掃描顯微鏡結(jié)果顯示，正常對照組可見紅色熒光標記的SP-A表達陽性細胞，體積較大，呈扁平或立方狀，多貼覆在肺泡壁的腔面。肺泡壁內(nèi)可見少量綠色熒光標記的α-SMA表達陽性的細胞。在矽肺模型組，可見矽結(jié)節(jié)內(nèi)有大量綠色熒光標記的α-SMA表達陽性的細胞，其間夾雜有一定數(shù)量的紅色熒光標記的SP-A表達陽性細胞。采用兩種蛋白熒光組合定位技術(shù)，可見一些紫粉色標記的細胞存在于矽結(jié)節(jié)內(nèi)，多分布在結(jié)節(jié)的邊緣區(qū)域，少量分布于結(jié)節(jié)內(nèi)部。表明，在矽結(jié)節(jié)中有肺泡II型上皮細胞的存在與增生，而部分肺泡II型上皮胞漿中有α-SMA陽性蛋白的表達。而Ac-SDKP治療組（包括預(yù)防治療和抗纖維化治療）α-SMA陽性表達的細胞數(shù)量較矽肺模型組減少，SP-A表達陽性細胞較矽肺模型組多。 Western blot結(jié)果顯示，與正常對照組相比，矽塵模型4周組α-SMA和Vimentin表達分別是對照組4周組的1.6倍和3.7倍，矽塵模型8周組α-SMA和Vimentin的表達分別是對照8周組的1.6倍和2.9倍。Ac-SDKP單獨給藥組和正常對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P0.05）。經(jīng)Ac-SDKP干預(yù)后，Ac-SDKP治療組和預(yù)防組中α-SMA表達分別是矽塵模型8周組的69%和67%，Vimentin的表達分別是矽塵模型8周組的59%和55%。而E-cad在矽肺模型4周組和8周組分別是正常對照4周組和8周組的49%和35%，SP-A的表達分別是正常對照組的50%和21%。經(jīng)Ac-SDKP干預(yù)后，Ac-SDKP治療組和預(yù)防組中E-cad的表達分別是矽塵模型8周組的2.3倍和2.6倍，SP-A的表達分別是矽塵模型8周組的4.5倍和4.4倍。 2Ac-SDKP對矽肺大鼠肺組織中HSP27、pHSP27和SNAI1、SNAI2以及I型、III型膠原蛋白表達的調(diào)節(jié)作用 免疫組織化學染色結(jié)果顯示，在正常對照組HSP27、pHSP27、SNAI1在大鼠血管和氣管平滑肌細胞中有少量陽性表達，而在矽肺大鼠間質(zhì)纖維化區(qū)域和矽結(jié)節(jié)中可見較多的HSP27、pHSP27、SNAI1陽性表達的細胞。 激光共聚焦掃描顯微鏡觀察顯示，紅色熒光標記的pHSP27（HSP27蛋白的活性形式）在氣管平滑肌管壁和肺泡壁內(nèi)呈弱陽性表達。而矽肺模型組的矽結(jié)節(jié)中有較多pHSP27蛋白呈強陽性表達，pHSP27蛋白多表達于結(jié)節(jié)內(nèi)細胞的胞漿中。而矽結(jié)節(jié)內(nèi)也可見大量綠色熒光標記的α-SMA。采用熒光重合疊加技術(shù)顯示，矽結(jié)節(jié)內(nèi)部分細胞呈紫粉色，即pHSP27蛋白（紅色熒光）和α-SMA蛋白（綠色熒光）重合疊加的結(jié)果。 Western blot結(jié)果顯示，矽肺模型組中HSP27和pHSP27蛋白的表達均上調(diào)。其中矽肺模型組4周和8周組HSP27蛋白的表達分別是對照4周和8周組的1.5倍和2.1倍，pHSP27的表達分別是對照組的2.1倍和2.1倍。Ac-SDKP單獨給藥組和正常對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P0.05）。Ac-SDKP干預(yù)處理后，能夠明顯下調(diào)HSP27和pHSP27蛋白的表達。其中Ac-SDKP治療組和預(yù)防組中HSP27蛋白表達分別是矽肺模型8周組的75%和65%，pHSP27蛋白表達分別是矽肺模型8周組的72%和68%。同時矽肺模型組中SNAI1、SNAI2蛋白的表達均上調(diào)。其中矽肺模型組4周和8周組SNAI1蛋白的表達分別是對照4周和8周組的3.1倍和2.7倍，SNAI2蛋白的表達分別是對照組的1.8倍和1.5倍。Ac-SDKP單獨給藥組和正常對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P0.05）。Ac-SDKP干預(yù)處理后，Ac-SDKP治療組和預(yù)防組中SNAI1蛋白的表達分別是矽肺模型8周組的62%和54%， SNAI2蛋白的表達分別是矽肺模型8周組79%和75%。此外，在矽肺模型組中I型膠原和III型膠原的表達均明顯上調(diào)。其中矽肺模型4周和8周組中I型膠原表達分別是對照4周和8周組的1.7倍和1.6倍，III型膠原表達分別是對照組的1.6倍和1.8倍。Ac-SDKP單獨給藥組和正常對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P0.05）。Ac-SDKP干預(yù)處理后I型膠原和III型膠原蛋白的表達均明顯下調(diào)，其中Ac-SDKP治療組和預(yù)防組中I型膠原蛋白的表達分別是矽肺模型8周組的78%和73%，III型膠原蛋白的表達分別是矽肺模型8周組的74%和73%。 3Ac-SDKP對TGF-β1誘導的人肺泡Ⅱ型上皮細胞的上皮標志蛋白E-cad、CK和間質(zhì)標志蛋白α-SMA、Vimentin表達的調(diào)節(jié)作用 免疫細胞化學染色結(jié)果顯示，正常對照組中CK在人肺泡II型上皮細胞中呈陽性表達，而α-SMA、Vimentin在正常對照組的人肺泡II型上皮細胞中呈陰性表達（或僅在細胞漿中有微量黃色著色），而在TGF-β1誘導72小時后，上皮細胞胞體由原來的類圓形向呈長梭形改變，胞漿豐富，胞核變圓變大，α-SMA、Vimentin在胞漿中表達增強，棕黃色著色明顯，而CK在TGF-β1誘導72小時后，在細胞中的表達卻不甚明顯；當Ac-SDKP干預(yù)處理后，α-SMA、Vimentin的染色強度TGF-β1誘導組較明顯減弱，細胞仍呈類圓形（無明顯長梭形形態(tài)的變化），而CK的表達較TGF-β1誘導組確有所增強。Ac-SDKP單獨給藥組和正常對照組相比在細胞形態(tài)和染色強度上沒有明顯區(qū)別。 Western blot和Real-time PCR結(jié)果顯示，TGF-β1誘導人肺泡Ⅱ型上皮細胞24、48、72小時，均能夠顯著降低上皮標志蛋白E-cad、CK蛋白的表達，同時增加了間質(zhì)標志蛋白α-SMA、 Vimentin的表達。其中，與對照組比較，TGF-β1誘導24、48、72小時，E-cad蛋白表達均下調(diào)到50%，CK蛋白均下調(diào)到40%；而在TGF-β1誘導72小時，E-cad mRNA表達下調(diào)到26%。與對照組比較，TGF-β1誘導24、48、72小時，α-SMA蛋白表達分別上調(diào)了1.9倍、2.5倍和1.8倍，Vimentin蛋白表達分別上調(diào)了1.6倍、2.3倍和1.9倍。給予Ac-SDKP干預(yù)處理后，均能增加TGF-β1誘導的人肺上皮細胞E-cad、CK的表達。其中干預(yù)作用24、48、72小時，E-cad蛋白表達分別為TGF-β1誘導組的1.8倍、1.8倍和2.0倍和CK蛋白表達分別為TGF-β1誘導組的2.4倍、2.3倍和2.6倍。而Ac-SDKP干預(yù)作用72小時，與TGF-β1誘導組相比較，E-cad mRNA的表達上調(diào)了3.4倍。而給予Ac-SDKP干預(yù)處理后，能夠降低間質(zhì)標志蛋白α-SMA、Vimentin的表達。其中干預(yù)作用24、48、72小時，α-SMA蛋白表達分別為TGF-β1誘導組的63%、72%、66%，Vimentin蛋白的表達分別是TGF-β1誘導組的69%、54%和68%。Ac-SDKP單獨給藥組和正常對照組相比蛋白水平和E-cad mRNA表達水平在各個時間點均無顯著性差異（P0.05）。 4Ac-SDKP對TGF-β1誘導的人肺泡Ⅱ型上皮細胞HSP27、pHSP27和SNAI1、SNAI2以及I型和III型膠原蛋白表達的調(diào)節(jié)作用 免疫細胞化學染色結(jié)果顯示，正常對照組中HSP27、pHSP27、SNAI1在人肺泡II型上皮細胞中呈陰性表達(或在細胞漿和核中有微量黃色著色)，而在TGF-β1誘導72小時后，伴隨著細胞胞體呈長梭形改變、胞漿豐富、胞核變圓變大，可見HSP27、pHSP27和SNAI1蛋白分別在胞漿和胞核中的著色加深。而Ac-SDKP干預(yù)處理后，HSP27、pHSP27、SNAI1的染色強度較TGF-β1誘導組明顯減弱，細胞仍呈類圓形。Ac-SDKP單獨給藥組和正常對照組相比在細胞形態(tài)和染色強度上沒有明顯區(qū)別。 激光共聚焦掃描顯微鏡結(jié)果顯示，經(jīng)TGF-β1誘導刺激后，細胞呈長梭形改變，胞漿內(nèi)HSP27蛋白綠色熒光強度明顯加強，胞核內(nèi)SNAI1蛋白表達紅色熒光強度增強，而SNAI2蛋白在胞核與胞漿內(nèi)均有紅色熒光表達；給予Ac-SDKP干預(yù)后，細胞向長梭形改變不明顯，胞漿內(nèi)HSP27蛋白綠色熒光強度明顯減弱，胞核內(nèi)SNAI1蛋白與胞漿和胞核內(nèi)SNAI2紅色熒光強度亦隨之減弱。 經(jīng)TGF-β1誘導刺激后，隨著細胞呈長梭形改變，F(xiàn)-actin在胞漿內(nèi)呈綠色肌絲樣結(jié)構(gòu)表達；給予Ac-SDKP干預(yù)后細胞長梭形改變不明顯，但F-actin綠色肌絲樣結(jié)構(gòu)表達較少。 Western blot和Real-time PCR結(jié)果顯示，與對照組比較，TGF-β1誘導的24、48、72小時，均能夠顯著上調(diào)人肺泡II型上皮細胞HSP27、pHSP27的表達。其中，TGF-β1誘導的24、48、72小時，HSP27蛋白表達分別是對照組的1.5倍、1.9倍和1.9倍，pHSP27蛋白表達分別是對照組的1.7倍、2.5倍和3.0倍。TGF-β1誘導72小時，HSP27mRNA表達是對照組的1.9倍。而在TGF-β1誘導后，人肺泡II型上皮細胞的核轉(zhuǎn)錄因子SNAI1和SNAI2的表達均上調(diào)，其中TGF-β1誘導的24、48、72小時，SNAI1的蛋白表達分別是對照組的2.3倍、2.2倍和1.3倍，SNAI2蛋白的表達分別是對照組的1.5倍、1.7倍和1.9倍。TGF-β1誘導72小時，SNAI1和SNAI2mRNA表達分別是對照組的3.1倍和2.3倍。同時，TGF-β1誘導24、48、72小時，伴隨人肺泡II型上皮細胞I型和III型膠原蛋白表達的增加，其中，I型膠原蛋白表達分別是對照組的1.5倍、2.1倍和2.2倍，III型膠原蛋白表達分別是對照組的1.5倍、1.9倍和2.5倍。 Ac-SDKP干預(yù)處理后，上述蛋白的表達均下調(diào)。干預(yù)作用24、48、72小時，HSP27蛋白表達分別是TGF-β1誘導組的71%、62%和74%，pHSP27蛋白表達分別是TGF-β1誘導組的56%、44%、44%。干預(yù)作用72小時，HSP27mRNA表達是TGF-β1誘導組的64%。Ac-SDKP干預(yù)處理后，核轉(zhuǎn)錄因子SNAI1和SNAI2的表達同時也被下調(diào)。其中，干預(yù)作用24、48、72小時，SNAI1蛋白的表達分別是TGF-β1誘導組的50%、71%和75%，SNAI2蛋白的表達分別是TGF-β1誘導組65%、64%、66%。干預(yù)作用72小時，SNAI1和SNAI2mRNA表達分別是TGF-β1誘導組的38%和77%。Ac-SDKP干預(yù)處理后，同時伴有I型和III型膠原蛋白表達的下降。其中，干預(yù)作用24、48、72小時，I型膠原蛋白表達分別是TGF-β1誘導組的62%、43%和66%，III型膠原蛋白表達分別是TGF-β1誘導組的66%、52%和44%。Ac-SDKP單獨給藥組和正常對照組相比，各個因子蛋白和mRNA的表達在各個時間點均無顯著性差異（P0.05）。 5Ac-SDKP對體外轉(zhuǎn)染HSP27干擾質(zhì)粒的人肺泡Ⅱ型上皮細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化的作用機制 體外用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染細胞的方法把HSP27的干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人肺泡Ⅱ型上皮細胞，經(jīng)TGF-β1誘導48小時。Western blot結(jié)果顯示，經(jīng)TGF-β1刺激的HSP27的干擾質(zhì)粒組與TGF-β1刺激的空質(zhì)粒組比較，SNAI1和α-SMA的表達下調(diào)，E-cad表達上調(diào)，同時伴有I型和III型膠原蛋白表達下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義（P 0.05），，而SNAI2蛋白的表達差異不具有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。Ac-SDKP干預(yù)處理空質(zhì)粒組與經(jīng)TGF-β1刺激的空質(zhì)粒組相比α-SMA、SNAI1、SNAI2表達下調(diào)，E-cad表達上調(diào)，I型和III型膠原蛋白表達下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義（P 0.05），其結(jié)果與HSP27的干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人肺泡Ⅱ型上皮細胞后的干預(yù)效果相似。 結(jié)論： 1矽肺纖維化發(fā)生時，存在（支氣管/肺泡）上皮細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化的病變過程。 2在矽肺大鼠模型中，Ac-SDKP能夠通過抑制（支氣管/肺泡）上皮細胞向肌成纖維細胞的轉(zhuǎn)化，進而抑制膠原的合成與沉積，發(fā)揮抗矽肺纖維化的作用。這一調(diào)控作用可能與調(diào)節(jié)HSP27蛋白的表達密切相關(guān)。 3體外細胞培養(yǎng)和HSP27的干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實驗證實，Ac-SDKP能夠通過下調(diào)HSP27的表達，抑制核轉(zhuǎn)錄因子SNAI1和α-SMA的表達，上調(diào)E-cad的表達，進而抑制I型與III型膠原的表達。Ac-SDKP能夠通過抑制上皮細胞向肌成纖維細胞分化而發(fā)揮其抗矽肺纖維化的作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R135.2

【引證文獻】

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本文編號：1843878