本文選題：線粒體鈣單向轉運體 + Pb~(2+)�。� 參考：《南方醫(yī)科大學》2014年碩士論文

【摘要】：背景 目前鉛中毒仍是公共衛(wèi)生學方面的難題之一,環(huán)境中鉛暴露對人體健康產生重大威脅。鉛是一種對全身組織有廣泛親和力的毒物,不僅對人體大腦、心臟、腎臟和肝臟有嚴重毒性,且鉛對健康危害最強的是神經毒性,導致神經功能紊亂,表現為鉛毒性腦病、周圍神經病變、聽力障礙和認知缺陷等。鉛作為中樞神經系統(tǒng)的毒物,對神經功能產生不可逆的毒性作用,尤其對正在發(fā)育的兒童神經系統(tǒng)。最近很多流行病學研究指出,妊娠期低濃度鉛暴露可導致兒童認知功能損傷和行為功能缺陷。同時有文獻表明在動物和人群中,鉛暴露可誘導發(fā)育中的中樞神經系統(tǒng)發(fā)生損害作用,表現為認知功能損傷、生長發(fā)育遲緩、多動癥和神經化學物質虧損等。因此研究鉛神經毒性的意義非常重大。目前鉛神經毒性機制主要包括鉛與鈣離子的競爭作用、鉛致細胞凋亡以及鉛對神經元的脂質過氧化損傷等。而產生鉛神經毒性的具體機制尚未清楚,但是有很多文獻報道鉛誘導的氧化應激是鉛神經毒性的機制之一[。研究表明低濃度鉛可通過損傷細胞膜、DNA和抗氧化防御系統(tǒng)來誘導細胞發(fā)生氧化應激。由于神經系統(tǒng)富含可被氧化的脂質,因此對鉛誘導的氧化損傷尤其敏感。鈣離子是細胞信號轉導過程中不可缺少的離子,具有多種重要的細胞功能。有文獻指出鉛誘導的神經毒性可能與鉛引起的鈣離子紊亂有關,這可能是因為鉛可擾亂鈣離子的運輸過程。據此研究鉛神經毒性機制是一個具有深遠意義的課題,闡明鉛致神經元細胞氧化應激機制對于明確鉛神經毒性以及調節(jié)相關的病理生理過程都有重要的意義,并為進一步明確相關疾病的發(fā)病機制和發(fā)現新的分子治療靶點提供基礎實驗依據。 線粒體在維持細胞內離子平衡、能量代謝以及對外界因素的應激方面發(fā)揮著重要的作用。而且線粒體是產生活性氧自由基的主要場所,過多的活性氧自由基(reactiveoxidespecies, ROS)和活性氮自由基(reactive nitrogen species，，RNS)的產生是發(fā)生氧化應激的必要條件。有文獻報道鉛可誘導活性氧自由基的產生對機體造成氧化損傷,而且通過降低質膜對活性氧自由基的防御能力和削弱細胞的抗氧化系統(tǒng)防御能力而間接導致氧化應激,比如消耗細胞內還原型谷胱甘肽(GSH)含量、抑制超氧化物歧化酶的活性和改變質膜的完整性等。線粒體鈣單向轉運體(mitochonddrialcalcium uniporter, MCU)位于線粒體內膜,是介導鈣離子從線粒體外進入線粒體基質的重要途徑,參與調節(jié)線粒體內外鈣的動態(tài)平衡,與細胞能量代謝和存活狀態(tài)有密切聯系。有文獻指出ROS調節(jié)著整個鈣信號網絡,同時細胞內的鈣穩(wěn)態(tài)也調節(jié)著ROS的產生。鈣離子作為第二信使,在細胞的生理病理功能中發(fā)揮著不可替代的作用,而且有報道稱氟化物誘導的細胞內鈣離子釋放導致活性氧自由基的活化,從而發(fā)揮其細胞毒性作用。而鉛離子的轉運機制與鈣離子的轉運機制相似,這有助于鉛離子進入細胞內并易于在細胞內分布,因此鉛可與某些鈣結合蛋白結合而產生細胞毒性。MCU是選擇性鈣離子通道,對細胞內鈣穩(wěn)態(tài)發(fā)揮著重要作用。據文獻報道,鉛是鈣離子的競爭性拮抗劑,而且鉛可通過阻礙外鈣濃度增加來抑制alpha7乙酰膽堿受體的活性而發(fā)揮鉛神經毒性作用。因此,盡管目前對鉛神經毒性機制的研究在各方面都取得了巨大成果,但是線粒體鈣單向轉運體是否在鉛誘導的神經元氧化應激這一過程起作用尚不清楚,而且鉛是否通過線粒體鈣單向轉運體來干擾線粒體內鈣平衡,從而打破細胞內鈣穩(wěn)態(tài)來發(fā)揮鉛的神經毒性作用,目前尚未見報道。 目的 本研究旨在探討低濃度鉛對人神經母細胞瘤(SH-SY5Y)細胞、新生大鼠海馬原代神經元和仔鼠海馬氧化應激的影響,觀察MCU蛋白表達和線粒體內鈣離子變化,進一步研究鉛神經毒性的分子機制。 方法 1.取處在對數生長期的SH-SY5Y細胞,分別設對照組、(2μM、10μM、50μM醋酸鉛處理組在5%CO2、37℃孵育48h后,顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學改變和MTT實驗檢測細胞活力。 2.用不同濃度鉛μM、2μM、10μM、50μM)處理SH-SY5Y細胞48h 后收獲細胞并檢測細胞內ROS和GSH的含量變化。 3.用ROS熒光探針DCFH-DA孵育細胞后,在激光共聚焦顯微鏡下記錄不同鉛處理組的ROS熒光強度變化。 4.用不同濃度鉛(0μM、2μM、10μM、50μM)處理SH-SY5Y細胞48h后收獲細胞并用western blot實驗方法檢測MCU和nNOS蛋白表達變化。 5.用0μM、10μM鉛處理SH-SY5Y細胞48h,再用MCU的激動劑精胺和抑制劑Ru360、MCU過表達質粒和干擾片段轉染處理后檢測細胞內的氧化應激情況。 6.用0μM和10μM鉛處理SH-SY5Y細胞處理48h再加MCU的激動劑(spermine)和抑制劑(Ru360)、MCU過表達質粒和干擾片段轉染處理后再用線粒體鈣指示劑Rhod-2孵育細胞后,加入2mM外鈣,在激光共聚焦顯微鏡下實時記錄不同鉛處理組的線粒體內鈣離子變化。 7.取新生乳鼠海馬神經元原代培養(yǎng)5天,用MAP-2抗體檢測新生乳鼠海馬神經元純度,分別設對照組、(2μM、10μM、50μM醋酸鉛處理組在5%CO2、37℃孵育24h后,顯微鏡下觀察神經元突起生長情況和MTT實驗檢測神經元細胞活力 8.用不同濃度鉛μM、2μM、10μM、50μM)處理原代培養(yǎng)海馬神經元24h后收獲細胞并檢測細胞內ROS和GSH的含量變化。 9.用OμM、10μM鉛處理原代海馬神經元24h后收獲細胞提取神經元全蛋白并檢測MCU蛋白表達變化。 10.用0μ M、10μ M鉛處理原代培養(yǎng)海馬神經元24h,再用MCU的激動劑精胺和抑制劑Ru360處理后檢測細胞內的氧化應激情況。 11.取新生仔鼠哺乳期染鉛21天后收獲仔鼠海馬組織,提取動物組織蛋白做western blot實驗,分別檢測動物海馬組織中MCU和nNOS蛋白表達變化。 12.實驗數據采用SPSS13.0進行統(tǒng)計分析,實驗結果以(mean±SD)表示,多組間比較采用完全隨機設計方差分析(one-way ANO VA)分析。進行多組間的兩兩比較時先采用Homogeneity-of-variance test檢測方差齊性,若方差齊性(P0.05)則采用LSD法,若方差不齊(P0.05)則采用Dunnett'T3法。P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。 結果 1.不同濃度的Pb2+、(0μ M、2μ M、10μ M、50μ M)處理SH-SY5Y細胞48h后,在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化,與control組相比,隨著鉛濃度的升高,細胞數目逐漸變少,細胞突起變短,體積變小,胞質濃縮。隨著鉛濃度的升高,細胞活力逐漸減低,在鉛濃度10μM組和50μM組分別下降了25.5%和47.0%,且差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 2.隨著鉛濃度的升高,ROS含量逐漸增多,在鉛濃度10μM和50μ M組分別增多了6.1%和17.3%,,而GSH含量分別減少了10.4%和35.6%,且差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 3. SH-SY5Y細胞ROS熒光強度發(fā)現隨著鉛濃度升高,ROS熒光強度不斷增強。 4.隨著鉛濃度不斷升高,nNOS蛋白表達顯著性增多而MCU蛋白表達則顯著性減少(P0.05)。 5.與control組相比,鉛單獨處理中的ROS顯著性升高而GSH則顯著性下降,MCU激動劑精胺以及MCU過表達的鉛處理組較鉛單獨處理組出現GSH顯著性升高、ROS顯著性降低(P0.05),MCU抑制劑Ru360以及MCU干擾的鉛處理組則出現相反的表現。 6.與control組相比,鉛單獨處理組在加入2mM外鈣時線粒體內鈣離子顯著性增高,而MCU激動劑精胺以及MCU過表達的鉛處理組較鉛單獨處理組出現線粒體內鈣離子顯著性升高(P0.05), MCU抑制劑Ru360以及MCU干擾的鉛處理組則出現相反的表現。 7.原代海馬神經元純度達90%以上,培養(yǎng)的海馬神經元可做后續(xù)實驗。原代培養(yǎng)海馬神經元經10μM鉛處理24h后神經元突起數目較對照組減少,MTT法檢測神經元細胞活力發(fā)現隨著鉛濃度的升高,神經元細胞活力不斷下降。 8.與control組相比,ROS含量隨著鉛濃度升高而顯著性增多,GSH含量則出現顯著性降低(P0.05)。 9.原代培養(yǎng)海馬神經元經10μM鉛處理24h后MCU蛋白表達減少,且有統(tǒng)計學意義(P0.05) 10.與control組相比,原代海馬神經元的鉛單獨處理ROS顯著性升高而GSH則顯著性下降,而MCU激動劑精胺的鉛處理組較鉛單獨處理組出現GSH顯著性升高、ROS顯著性降低(P0.05), MCU抑制劑Ru360的鉛處理組則出現相反的表現,與在SH-SY5Y細胞中的結果一致。 11.在動物實驗中,哺乳期染鉛組與對照組相比,仔鼠海馬神經元的MCU蛋白表達出現顯著性降低,而nNOS蛋白表達顯著性升高(P0.05) 結論 本研究的實驗結果顯示,鉛可誘導人SH-SY5Y細胞、新生大鼠海馬原代神經元和哺乳期染鉛仔鼠海馬發(fā)生氧化應激,MCU參與了這一鉛誘導的氧化應激的過程,線粒體內鈣離子變化在其中起重要作用。
[Abstract]:Background

Lead is a toxic substance with wide affinity to human body tissues . It is suggested that lead exposure can induce oxidative stress in children by damaging cell membrane , DNA and antioxidant defense system .

It is reported that lead is a competitive antagonist of calcium ions , and it can inhibit the activity of superoxide dismutase ( ROS ) and change the integrity of the membrane .

Purpose

The purpose of this study was to investigate the effects of low concentration of lead on oxidative stress in primary and neonatal rat hippocampal neurons and neonatal rat hippocampal neurons , observe the expression of MCU protein and the changes of calcium ion in mitochondria , and further study the molecular mechanism of lead neurotoxicity .

method

1 . After incubation for 48 hours at 5 % CO2 and 37 鈩

本文編號：1842132