本文選題：納米氧化鋅 + HL-7702肝細胞�。� 參考：《中國計量學院》2012年碩士論文

【摘要】：納米氧化鋅具有極強的抗氧化性、抗腐蝕性、光催化性和獨特的抗紫外線性，使其在光電學、橡膠工業(yè)、日用化工、食品添加劑、生物醫(yī)學等方面應用廣泛。納米氧化鋅可通過皮膚、呼吸道或消化道進入生物體并在體內(nèi)積蓄，但機體很難排除這類微小物質，因此潛在一定的生物毒性效應，對其生物安全性的研究已成為目前的研究熱點。為了探討納米氧化鋅是否具有肝腎細胞毒性，本研究以人正常肝細胞HL-7702和人胚腎細胞HEK293為研究對象，首先通過形態(tài)學觀察、MTT(噻唑鹽)比色法來檢測納米氧化鋅對細胞活性的影響，然后通過單細胞凝膠電泳和微核試驗檢測其誘導的單鏈DNA斷裂程度和染色體損傷程度。檢測細胞內(nèi)活性氧水平(包括GSH、MDA和SOD水平)，考馬斯亮藍法測定蛋白質羰基含量來探討納米氧化鋅對細胞的氧化損傷作用及可能機制。同時，利用DNA-laddering法來研究納米氧化鋅誘導的細胞凋亡作用。 一、納米氧化鋅對HL-7702及HEK293細胞的毒性作用研究 通過透射電鏡確定納米氧化鋅粒子粒徑分布，制備成不同濃度的含氧化鋅培養(yǎng)液與人正常肝細胞HL-7702及人胚腎細胞HEK293接觸培養(yǎng)，，通過倒置顯微鏡觀察其形態(tài)，采取MTT法檢測細胞毒性，計算相對增值率(RGR)，并進行毒性評價。 形態(tài)學觀察結果顯示，高劑量納米氧化鋅粒子作用細胞對細胞形態(tài)的影響更為明顯，可導致細胞形態(tài)變化，細胞凋亡或壞死。MTT法進行細胞毒性檢測結果表明，對于HL-7702和HEK293細胞，當納米氧化鋅粒子濃度分別達到10μg/mL和25μg/mL時，納米氧化鋅實驗組與對照組組相比出現(xiàn)顯著性差異(P0.05)，并表現(xiàn)出濃度-效應關系。 二、納米氧化鋅對HL-7702及HEK293細胞的遺傳毒性 探討納米氧化鋅對人肝腎細胞的遺傳毒性效應，采用不同濃度納米氧化鋅10、25、50、75和100μg/mL對分別對HL-7702和HEK293細胞進行染毒12h，24h和48h后，用單細胞凝膠電泳技術檢測細胞的DNA的損傷程度。并采用微核試驗檢測染毒后雙核細胞的微核發(fā)生率，以期得出納米氧化鋅體外遺傳毒性。 結果顯示，納米氧化鋅染毒肝腎細胞后，隨著培養(yǎng)基中納米氧化鋅濃度的增加，與對照組相比，高劑量染毒組細胞頭部DNA含量(Head DNA%)顯著降低，尾部DNA含量(Tail DNA%)、尾矩(Tail Moment)、Olive尾矩(Olive Tail Moment)數(shù)值顯著升高(P＜0.05)；微核試驗發(fā)現(xiàn)染毒組的微核率顯著升高。研究結果提示，高濃度的納米氧化鋅可引起人肝胚腎細胞DNA和染色體水平損傷，表現(xiàn)出遺傳毒性效應，認為其對細胞DNA的損傷個的納米氧化鋅致體外細胞毒性的主要機制之一。 三、納米氧化鋅致HL-7702及HEK293細胞氧化損傷作用的研究 驗證納米氧化鋅是否致使HL-7702及HEK293細胞產(chǎn)生氧化損傷作用，采用不同濃度的納米氧化鋅10、25、50、75和100μg/mL對細胞進行染毒處理，24h后收集細胞，檢測其谷胱甘肽GSH、丙二醛MDA和超氧化物歧化酶SOD水平，探討細胞內(nèi)氧化應激水平，并通過檢測蛋白質羰基含量來反映納米材料對蛋白質的氧化損傷作用。結果表明，在納米氧化鋅處于一定劑量范圍內(nèi)(≤100μg/mL)，納米氧化鋅處理組總SOD和GSH酶活力降低，而MDA含量增加，且呈現(xiàn)一定的劑量-效應關系，在高濃度納米氧化鋅組中蛋白質羰基含量與對照組相比有顯著性的升高(P0.05)。進一步證實納米氧化鋅可對人肝腎細胞產(chǎn)生明顯氧化損傷作用，并認為氧化損傷是納米氧化鋅導致細胞毒性的主要機制之一。 四、納米氧化鋅致HL-7702及HEK293細胞凋亡作用的研究 采用DNA-ladder法探討納米氧化鋅對人肝腎細胞凋亡作用的影響，結果表明：納米氧化鋅處理細胞后進行的DNA電泳圖顯示，DNA在100-200bp發(fā)生不同程度的特異性斷裂，出現(xiàn)較明顯的DNA ladder片段，提示納米氧化鋅能誘導人肝腎細胞發(fā)生凋亡作用。納米氧化鋅誘發(fā)的細胞凋亡可能是發(fā)生細胞毒性的機制之一，其有關機理還有待進一步研究。
[Abstract]:Nano Zinc Oxide has highly resistant to oxidation, corrosion resistance, photocatalysis and unique UV resistance, the photoelectricity, rubber industry, daily chemical, food additives, biomedical and other aspects of a wide range of applications. Nano Zinc Oxide through the skin, respiratory or digestive tract into organisms and accumulated in the body, but it is difficult for the body to eliminate this kind of small matter, therefore some potential biological toxicity effects on the biological safety has become a hot research topic at present. In order to investigate whether Zinc Oxide has nano liver and kidney cells toxicity, this study in normal human liver cell HL-7702 and human embryo kidney cell HEK293 as the research object, firstly by morphological observation MTT, (MTT) colorimetric method to detect the effect of nano Zinc Oxide on cell activity, followed by single cell gel electrophoresis and micronucleus test to detect the induction of single strand DNA fragmentation and dyeing Body injury. The level of intracellular reactive oxygen species detection (including GSH, MDA and SOD), to explore the effect of nano Zinc Oxide oxidative damage to cells and the possible mechanism of the determination of protein carbonyl content Kaumas Bradford method. At the same time, to study the cell apoptosis induced by nano Zinc Oxide DNA-laddering method.
Study on the toxic effect of nano Zinc Oxide on HL-7702 and HEK293 cells
By transmission electron microscopy to determine the particle size distribution of nano Zinc Oxide, prepared by different concentration of HL-7702 and liquid containing Zinc Oxide culture and human normal liver cell embryo kidney cell HEK293 contact culture, were observed by inverted microscope, cell toxicity test MTT method, calculation of the value-added rate (RGR), and toxicity evaluation.
Morphological observation showed that the effect of high dose of nano particle effects on cell morphology of Zinc Oxide cells is more obvious, can lead to changes in cell morphology, cell apoptosis or necrosis of.MTT cell toxicity test showed that the HL-7702 and HEK293 cells, when the nano particle concentration Zinc Oxide reached 10 g/mL and 25 g/mL, nano Zinc Oxide the experimental group and the control group was significantly difference (P0.05), and showed dose effect relationship.
Two, the genetic toxicity of nanoscale Zinc Oxide to HL-7702 and HEK293 cells
To investigate the genetic toxic effect on liver and kidney cells of nano Zinc Oxide, with different concentrations of nano Zinc Oxide 10,25,50,75 and 100 g/mL respectively for 12h exposure on HL-7702 and HEK293 cells, 24h and 48h after injury were detected by single cell gel electrophoresis DNA and micronucleus test were detected. The incidence after binucleate cells. Micronucleus, in order to obtain nano Zinc Oxide in vitro genotoxicity.
The results showed that liver and kidney cells after exposure to nano Zinc Oxide, with the increase of nano Zinc Oxide culture medium concentrations, compared with the control group, high dose group cells (Head DNA%) head DNA content decreased significantly, the tail DNA content (Tail DNA%), tail moment (Tail Moment), Olive (Olive Tail Moment) tail moment value increased significantly (P < 0.05); micronucleus test found that the micronuclear rates increased. The results suggest that high concentrations of nano DNA Zinc Oxide can cause renal cell and embryo liver injury showed chromosome level, genetic toxicity effect, that the main mechanism of in vitro cytotoxicity induced on DNA damage induced by a nano Zinc Oxide one.
Three, study on the oxidative damage of HL-7702 and HEK293 cells induced by nano Zinc Oxide
Verify whether Zinc Oxide led HL-7702 and nano HEK293 cells to produce oxidative damage, with different concentrations of nano 10,25,50,75 and Zinc Oxide 100 g/mL cells were treated with 24h, were collected after the detection of glutathione GSH and malondialdehyde MDA superoxide dismutase SOD levels of oxidative stress in cells, and the protein carbonyl content test to reflect the effects of nanomaterials on oxidative damage of proteins. The results showed that the nano in Zinc Oxide in a certain dose range (less than 100 g/mL), Zinc Oxide group SOD and nano GSH enzyme activity decreased, while the content of MDA increased, and showed a dose effect, in the high concentration of nano protein in Zinc Oxide group the carbonyl content increased as compared with the control group there was significant (P0.05). Further confirmed that Zinc Oxide can produce obvious nano oxygen on human liver and kidney cells of injury, It is also considered that oxidative damage is one of the main mechanisms of the cytotoxicity of nanoscale Zinc Oxide.
Four, study on the effect of nano Zinc Oxide on the apoptosis of HL-7702 and HEK293 cells
To investigate the effect of Zinc Oxide, nano effect on human liver and kidney cells apoptosis by DNA-ladder method showed that DNA electrophoresis for processing nano Zinc Oxide after the cells showed that DNA specific fracture at different level of 100-200bp, DNA fragment of ladder obviously, suggesting that Zinc Oxide nano induced apoptosis of human liver cells. The apoptosis of nano Zinc Oxide may be one of the mechanisms of induced cell toxicity occurred, its mechanism remains to be further studied.

【學位授予單位】：中國計量學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R114;TB383.1

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