發(fā)布時間：2018-04-13 02:23

  本文選題：納米銀 + 人皮膚成纖維細胞　； 參考：《東南大學》2015年博士論文

【摘要】：隨著納米粒子在生物醫(yī)學領域中的應用日趨廣泛,納米粒子對人體健康的影響即納米毒性引起了人們的密切關注。雖然研究者已采用多種方法從不同層面研究了納米粒子的毒性,但目前人們對納米粒子與活細胞的相互作用仍知之甚少,更重要的是采用動物整體實驗、細胞學實驗和傳統(tǒng)分子生物學方法不能系統(tǒng)全面地解釋納米粒子與細胞相互作用的機理。高通量生物組學技術(基因表達譜芯片技術、蛋白質(zhì)組學技術、SOLiD測序技術等)的快速發(fā)展為全面、系統(tǒng)地在分子水平上研究納米粒子毒性機理提供了新方法和新技術手段。但迄今為止,對納米粒子作用后引起的細胞中基因、蛋白質(zhì)、microRNA表達譜的變化都是采用單一的生物組學方法分別進行研究的,因此只能獲知納米粒子對細胞影響的一個方面,而無法對納米粒子的毒性進行系統(tǒng)整體的分析。納米銀由于效果強、殺菌光譜,在醫(yī)學領域獲得了廣泛的應用,但由于納米銀對生物系統(tǒng)影響的復雜性,其毒性作用還有許多方面未被揭示。目前已有研究者開始研究納米銀對細胞內(nèi)基因、蛋白質(zhì)表達譜的影響,但尚未見對細胞中microRNA表達譜影響的報道,也未見聯(lián)合多種生物組學方法系統(tǒng)研究納米銀毒性機制的報道。本論文將通過對將基因、microRNA、蛋白質(zhì)表達數(shù)據(jù)的聯(lián)合分析,探討microRNA在納米銀對人皮膚成纖維細胞毒性中的調(diào)控機制。本論文的具體內(nèi)容如下：1、采用硼氫化鈉還原硝酸銀的方法制備納米銀,通過調(diào)節(jié)硼氫化鈉的濃度和改變?nèi)軇┑姆N類制備一系列納米銀溶液。紫外可見分光光度計和透射電鏡表征結果顯示,還原劑的濃度和溶劑的種類均會影響納米銀的大小和形狀。用二蒸水制備的納米銀形狀均一,大部分呈球形。為了獲得實驗用20nm的納米銀,確定以二蒸水為溶劑、濃度為2mM的硼氫化鈉和硝酸銀溶液進行制備。2、采用MTT法、實時細胞電阻抗儀、光學顯微鏡、熒光顯微鏡和掃描電鏡對納米銀對人皮膚成纖維細胞增殖和形貌的影響進行分析,采用流式細胞術研究納米銀對細胞周期和細胞凋亡的影響,進一步采用原子吸收光譜儀分析納米銀在細胞中的攝取。結果顯示,低濃度的納米銀(1、10、50、100μM)作用細胞72h內(nèi),細胞毒性均為0級,高濃度納米銀(200、300μM)在作用細胞48h后均出現(xiàn)1級細胞毒性,且細胞的規(guī)則排列發(fā)生變化。而200μM納米銀作用細胞1、4、8h時雖未產(chǎn)生細胞毒性,影響細胞形態(tài),但已使細胞滯留于DNA合成期,且在8h時納米銀對細胞周期和凋亡的影響最為顯著。此外,隨著作用時間的增加,細胞中攝取的納米銀量顯著升高。3、采用基于二維差異凝膠電泳分離技術和質(zhì)譜鑒定的蛋白質(zhì)組學技術研究200／μM納米銀作用1、4、8h后人皮膚成纖維細胞中的蛋白質(zhì)表達譜,篩選獲得25種在三個時間點均發(fā)生差異表達的功能蛋白質(zhì),其中發(fā)生上調(diào)表達的蛋白質(zhì)19種,發(fā)生下調(diào)表達的蛋白質(zhì)4種,既有上調(diào)又有下調(diào)的蛋白質(zhì)2種。進一步采用Cluster Treeview, Gosurfer、GenMAPP、Ingenuity Pathway Analysis軟件對差異表達蛋白質(zhì)進行聚類、Gene Ontology (GO)功能分類、生物學通路和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡分析,發(fā)現(xiàn)25種差異表達蛋白質(zhì)影響多個GO功能類別,并參與31條生物學通路和4個蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡。納米銀可能影響細胞信號傳導、細胞骨架、細胞粘附、細胞能量代謝、mRNA加工等功能,抑制細胞增殖,誘導細胞凋亡。4、采用SOLiD測序技術分析2001μM納米銀對人皮膚成纖維細胞中microRNA表達譜的影響,在1、4、8h三個時間點分別獲得59、143和142個差異表達microRNA,其中不重復的共有246個。進一步使用miRanda、TargetScan和PicTar三種方法同時對差異表達microRNA進行靶基因預測,在三個時間點分別獲得1747個、2928個和2667個靶基因,其中不重復的共有3594個。生物信息學分析發(fā)現(xiàn),差異表達microRNA靶基因顯著影響171、272、233個生物學過程、分子功能和細胞組分第三層次的功能類別,并參與120、132和129條生物學通路,其功能涉及細胞粘附、細胞骨架、細胞凋亡、細胞周期、炎癥反應等。5、將納米銀作用細胞后的蛋白質(zhì)表達數(shù)據(jù)和本課題組前期獲得的基因表達數(shù)據(jù)進行比較,發(fā)現(xiàn)兩者在種類、數(shù)量和表達模式上都存在明顯差別。對比差異表達基因、microRNA和蛋白質(zhì)涉及的GO生物學過程功能類別和參與的生物學通路,發(fā)現(xiàn)三者之間存在差異。通過聯(lián)合分析microRNA、基因和蛋白質(zhì)表達數(shù)據(jù),在1、4、8h三個時間點分別匹配到具有生物學意義的microRNA-靶基因作用對36、429、116個,microRNA-靶蛋白質(zhì)作用對2、1、3個,包含的靶基因和靶蛋白質(zhì)有28、186和82個,不重復的共257個。在匹配到的microRNA-靶基因／靶蛋白質(zhì)對找到對應3個基因／蛋白質(zhì)對的6個microRNA,而靶基因-蛋白質(zhì)對的表達分別受多個microRNA的共同調(diào)控,microRNA本身的表達方式也會影響其對靶基因／靶蛋白質(zhì)的調(diào)控效果,microRNA可通過降解mRNA和抑制翻譯兩種方式發(fā)揮對靶基因-蛋白質(zhì)對的調(diào)控作用。對257個microRNA靶基因／靶蛋白質(zhì)的生物信息學分析顯示,其功能主要與細胞通訊和細胞代謝過程有關,并且參與57條生物學通路。而差異表達nicroRNA和調(diào)控的靶基因-蛋白質(zhì)對共同參與4條主要的生物學通路,即“肌動蛋白細胞骨架的調(diào)節(jié)”、“肝細胞生長因子受體”、“胰島素信號”和‘'MAPK信號通路”。納米銀可能通過差異表達microRNA調(diào)控這4條通路中的靶基因和靶蛋白質(zhì),最終導致細胞骨架的破壞、ATP水平的降低和細胞凋亡的產(chǎn)生。6、采用Western blot和qRT-PCR對選定的4種蛋白質(zhì)和8個microRNA的表達值進行測定,證實納米銀與細胞作用的蛋白質(zhì)組學和nicroRNA測序?qū)嶒灲Y果的可信性。進一步采用肌動蛋白細胞骨架染色試劑盒、ATP檢測試劑盒和Hoechst熒光染色法對納米銀作用1、4、8、24、48和72h后細胞骨架、細胞內(nèi)ATP含量和細胞凋亡進行分析,證實生物信息學分析結果,證明納米銀主要通過破壞細胞骨架、降低ATP水平和誘導細胞凋亡這三個方面的作用引起人皮膚成纖維細胞毒性。7、采用SOLiD測序技術分析200μM納米金對人皮膚成纖維細胞中microRNA表達譜的影響,在1、4、8h三個時間點分別獲得109、78和124個差異表達]microRNA。進一步使用miRanda, TargetScan和PicTar同時對差異表達microRNA進行靶基因預測,在三個時間點分別獲得2403個、2044個和3002個靶基因,這些靶基因顯著影響208、193、249個生物學過程、分子功能和細胞組分第三層次的功能類別,并參與126、125和129條生物學通路。通過聯(lián)合分析microRNA、基因和蛋白質(zhì)表達數(shù)據(jù),在1、4、8h三個時間點分別匹配到具有生物學意義的microRNA-靶基因／蛋白質(zhì)作用對132、38、137個,包含的不重復的靶基因和靶蛋白質(zhì)共187個。對匹配的187個microRNA靶基因／靶蛋白質(zhì)的生物信息學分析顯示,其功能主要與細胞代謝過程有關,并且參與71條生物學通路。而差異表達microRNA和調(diào)控的靶基因-蛋白質(zhì)對共同參與2條主要的生物學通路,即"mRNA加工”和"MAPK信號通路”。納米金可能通過差異表達microRNA調(diào)控這2條通路中的靶基因和靶蛋白質(zhì),影響細胞周期但抑制細胞凋亡。8、從細胞水平、蛋白質(zhì)水平和microRNA水平對納米銀與納米金對人皮膚成纖維細胞的影響進行比較。結果發(fā)現(xiàn),這兩種納米粒子對細胞增殖、細胞周期、細胞骨架、氧化應激、能量代謝、細胞凋亡等方面的影響均存在差異。進一步在蛋白質(zhì)水平上的比較發(fā)現(xiàn),這兩種納米粒子誘導的差異表達蛋白質(zhì)中相同的只有5種,生物學過程、分子功能、細胞組分分類中包含蛋白質(zhì)最多的類別基本相同,而納米銀影響的通路數(shù)量(31條)多于納米金(24條)。在]microRNA水平上的比較顯示,納米銀和納米金作用細胞后差異表達microRNA的種類、靶基因／靶蛋白質(zhì)功能、參與的生物學通路和對生物學通路的影響均不同。與納米銀相比,納米金影響細胞周期,減弱對ATP合成的抑制和對細胞骨架的損傷,并抑制細胞凋亡的產(chǎn)生,最終未產(chǎn)生細胞毒性。而兩種納米粒子作用后細胞中活性氧水平的差異與納米金無細胞毒性而納米銀誘導產(chǎn)生細胞毒性有關。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：東南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R114
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本文編號：1742521