本文選題：納米銀 + 人皮膚成纖維細(xì)胞�。� 參考：《東南大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：隨著納米粒子在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用日趨廣泛,納米粒子對人體健康的影響即納米毒性引起了人們的密切關(guān)注。雖然研究者已采用多種方法從不同層面研究了納米粒子的毒性,但目前人們對納米粒子與活細(xì)胞的相互作用仍知之甚少,更重要的是采用動物整體實驗、細(xì)胞學(xué)實驗和傳統(tǒng)分子生物學(xué)方法不能系統(tǒng)全面地解釋納米粒子與細(xì)胞相互作用的機理。高通量生物組學(xué)技術(shù)(基因表達譜芯片技術(shù)、蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)、SOLiD測序技術(shù)等)的快速發(fā)展為全面、系統(tǒng)地在分子水平上研究納米粒子毒性機理提供了新方法和新技術(shù)手段。但迄今為止,對納米粒子作用后引起的細(xì)胞中基因、蛋白質(zhì)、microRNA表達譜的變化都是采用單一的生物組學(xué)方法分別進行研究的,因此只能獲知納米粒子對細(xì)胞影響的一個方面,而無法對納米粒子的毒性進行系統(tǒng)整體的分析。納米銀由于效果強、殺菌光譜,在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域獲得了廣泛的應(yīng)用,但由于納米銀對生物系統(tǒng)影響的復(fù)雜性,其毒性作用還有許多方面未被揭示。目前已有研究者開始研究納米銀對細(xì)胞內(nèi)基因、蛋白質(zhì)表達譜的影響,但尚未見對細(xì)胞中microRNA表達譜影響的報道,也未見聯(lián)合多種生物組學(xué)方法系統(tǒng)研究納米銀毒性機制的報道。本論文將通過對將基因、microRNA、蛋白質(zhì)表達數(shù)據(jù)的聯(lián)合分析,探討microRNA在納米銀對人皮膚成纖維細(xì)胞毒性中的調(diào)控機制。本論文的具體內(nèi)容如下：1、采用硼氫化鈉還原硝酸銀的方法制備納米銀,通過調(diào)節(jié)硼氫化鈉的濃度和改變?nèi)軇┑姆N類制備一系列納米銀溶液。紫外可見分光光度計和透射電鏡表征結(jié)果顯示,還原劑的濃度和溶劑的種類均會影響納米銀的大小和形狀。用二蒸水制備的納米銀形狀均一,大部分呈球形。為了獲得實驗用20nm的納米銀,確定以二蒸水為溶劑、濃度為2mM的硼氫化鈉和硝酸銀溶液進行制備。2、采用MTT法、實時細(xì)胞電阻抗儀、光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡和掃描電鏡對納米銀對人皮膚成纖維細(xì)胞增殖和形貌的影響進行分析,采用流式細(xì)胞術(shù)研究納米銀對細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響,進一步采用原子吸收光譜儀分析納米銀在細(xì)胞中的攝取。結(jié)果顯示,低濃度的納米銀(1、10、50、100μM)作用細(xì)胞72h內(nèi),細(xì)胞毒性均為0級,高濃度納米銀(200、300μM)在作用細(xì)胞48h后均出現(xiàn)1級細(xì)胞毒性,且細(xì)胞的規(guī)則排列發(fā)生變化。而200μM納米銀作用細(xì)胞1、4、8h時雖未產(chǎn)生細(xì)胞毒性,影響細(xì)胞形態(tài),但已使細(xì)胞滯留于DNA合成期,且在8h時納米銀對細(xì)胞周期和凋亡的影響最為顯著。此外,隨著作用時間的增加,細(xì)胞中攝取的納米銀量顯著升高。3、采用基于二維差異凝膠電泳分離技術(shù)和質(zhì)譜鑒定的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究200／μM納米銀作用1、4、8h后人皮膚成纖維細(xì)胞中的蛋白質(zhì)表達譜,篩選獲得25種在三個時間點均發(fā)生差異表達的功能蛋白質(zhì),其中發(fā)生上調(diào)表達的蛋白質(zhì)19種,發(fā)生下調(diào)表達的蛋白質(zhì)4種,既有上調(diào)又有下調(diào)的蛋白質(zhì)2種。進一步采用Cluster Treeview, Gosurfer、GenMAPP、Ingenuity Pathway Analysis軟件對差異表達蛋白質(zhì)進行聚類、Gene Ontology (GO)功能分類、生物學(xué)通路和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析,發(fā)現(xiàn)25種差異表達蛋白質(zhì)影響多個GO功能類別,并參與31條生物學(xué)通路和4個蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)。納米銀可能影響細(xì)胞信號傳導(dǎo)、細(xì)胞骨架、細(xì)胞粘附、細(xì)胞能量代謝、mRNA加工等功能,抑制細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。4、采用SOLiD測序技術(shù)分析2001μM納米銀對人皮膚成纖維細(xì)胞中microRNA表達譜的影響,在1、4、8h三個時間點分別獲得59、143和142個差異表達microRNA,其中不重復(fù)的共有246個。進一步使用miRanda、TargetScan和PicTar三種方法同時對差異表達microRNA進行靶基因預(yù)測,在三個時間點分別獲得1747個、2928個和2667個靶基因,其中不重復(fù)的共有3594個。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),差異表達microRNA靶基因顯著影響171、272、233個生物學(xué)過程、分子功能和細(xì)胞組分第三層次的功能類別,并參與120、132和129條生物學(xué)通路,其功能涉及細(xì)胞粘附、細(xì)胞骨架、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、炎癥反應(yīng)等。5、將納米銀作用細(xì)胞后的蛋白質(zhì)表達數(shù)據(jù)和本課題組前期獲得的基因表達數(shù)據(jù)進行比較,發(fā)現(xiàn)兩者在種類、數(shù)量和表達模式上都存在明顯差別。對比差異表達基因、microRNA和蛋白質(zhì)涉及的GO生物學(xué)過程功能類別和參與的生物學(xué)通路,發(fā)現(xiàn)三者之間存在差異。通過聯(lián)合分析microRNA、基因和蛋白質(zhì)表達數(shù)據(jù),在1、4、8h三個時間點分別匹配到具有生物學(xué)意義的microRNA-靶基因作用對36、429、116個,microRNA-靶蛋白質(zhì)作用對2、1、3個,包含的靶基因和靶蛋白質(zhì)有28、186和82個,不重復(fù)的共257個。在匹配到的microRNA-靶基因／靶蛋白質(zhì)對找到對應(yīng)3個基因／蛋白質(zhì)對的6個microRNA,而靶基因-蛋白質(zhì)對的表達分別受多個microRNA的共同調(diào)控,microRNA本身的表達方式也會影響其對靶基因／靶蛋白質(zhì)的調(diào)控效果,microRNA可通過降解mRNA和抑制翻譯兩種方式發(fā)揮對靶基因-蛋白質(zhì)對的調(diào)控作用。對257個microRNA靶基因／靶蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)分析顯示,其功能主要與細(xì)胞通訊和細(xì)胞代謝過程有關(guān),并且參與57條生物學(xué)通路。而差異表達nicroRNA和調(diào)控的靶基因-蛋白質(zhì)對共同參與4條主要的生物學(xué)通路,即“肌動蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)”、“肝細(xì)胞生長因子受體”、“胰島素信號”和‘'MAPK信號通路”。納米銀可能通過差異表達microRNA調(diào)控這4條通路中的靶基因和靶蛋白質(zhì),最終導(dǎo)致細(xì)胞骨架的破壞、ATP水平的降低和細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生。6、采用Western blot和qRT-PCR對選定的4種蛋白質(zhì)和8個microRNA的表達值進行測定,證實納米銀與細(xì)胞作用的蛋白質(zhì)組學(xué)和nicroRNA測序?qū)嶒灲Y(jié)果的可信性。進一步采用肌動蛋白細(xì)胞骨架染色試劑盒、ATP檢測試劑盒和Hoechst熒光染色法對納米銀作用1、4、8、24、48和72h后細(xì)胞骨架、細(xì)胞內(nèi)ATP含量和細(xì)胞凋亡進行分析,證實生物信息學(xué)分析結(jié)果,證明納米銀主要通過破壞細(xì)胞骨架、降低ATP水平和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡這三個方面的作用引起人皮膚成纖維細(xì)胞毒性。7、采用SOLiD測序技術(shù)分析200μM納米金對人皮膚成纖維細(xì)胞中microRNA表達譜的影響,在1、4、8h三個時間點分別獲得109、78和124個差異表達]microRNA。進一步使用miRanda, TargetScan和PicTar同時對差異表達microRNA進行靶基因預(yù)測,在三個時間點分別獲得2403個、2044個和3002個靶基因,這些靶基因顯著影響208、193、249個生物學(xué)過程、分子功能和細(xì)胞組分第三層次的功能類別,并參與126、125和129條生物學(xué)通路。通過聯(lián)合分析microRNA、基因和蛋白質(zhì)表達數(shù)據(jù),在1、4、8h三個時間點分別匹配到具有生物學(xué)意義的microRNA-靶基因／蛋白質(zhì)作用對132、38、137個,包含的不重復(fù)的靶基因和靶蛋白質(zhì)共187個。對匹配的187個microRNA靶基因／靶蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)分析顯示,其功能主要與細(xì)胞代謝過程有關(guān),并且參與71條生物學(xué)通路。而差異表達microRNA和調(diào)控的靶基因-蛋白質(zhì)對共同參與2條主要的生物學(xué)通路,即"mRNA加工”和"MAPK信號通路”。納米金可能通過差異表達microRNA調(diào)控這2條通路中的靶基因和靶蛋白質(zhì),影響細(xì)胞周期但抑制細(xì)胞凋亡。8、從細(xì)胞水平、蛋白質(zhì)水平和microRNA水平對納米銀與納米金對人皮膚成纖維細(xì)胞的影響進行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn),這兩種納米粒子對細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞骨架、氧化應(yīng)激、能量代謝、細(xì)胞凋亡等方面的影響均存在差異。進一步在蛋白質(zhì)水平上的比較發(fā)現(xiàn),這兩種納米粒子誘導(dǎo)的差異表達蛋白質(zhì)中相同的只有5種,生物學(xué)過程、分子功能、細(xì)胞組分分類中包含蛋白質(zhì)最多的類別基本相同,而納米銀影響的通路數(shù)量(31條)多于納米金(24條)。在]microRNA水平上的比較顯示,納米銀和納米金作用細(xì)胞后差異表達microRNA的種類、靶基因／靶蛋白質(zhì)功能、參與的生物學(xué)通路和對生物學(xué)通路的影響均不同。與納米銀相比,納米金影響細(xì)胞周期,減弱對ATP合成的抑制和對細(xì)胞骨架的損傷,并抑制細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生,最終未產(chǎn)生細(xì)胞毒性。而兩種納米粒子作用后細(xì)胞中活性氧水平的差異與納米金無細(xì)胞毒性而納米銀誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞毒性有關(guān)。
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【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R114
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本文編號：1742521