發(fā)布時間：2018-03-26 01:01

  本文選題：碳點　切入點：急性毒性　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2014年博士論文

【摘要】：將納米材料用于生物標(biāo)記與診斷成像，是當(dāng)前納米科技應(yīng)用于腫瘤醫(yī)學(xué)新興的研究領(lǐng)域，如何應(yīng)用納米材料獨特的小尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)、量子效應(yīng)、光、電、磁效應(yīng)等性質(zhì)來設(shè)計生物相容性良好的腫瘤診斷分子探針，提高腫瘤標(biāo)志物檢測的特異性與靈敏度，是目前腫瘤醫(yī)學(xué)對納米科技提出的極具挑戰(zhàn)性的問題。 納米材料要轉(zhuǎn)化為醫(yī)藥產(chǎn)品應(yīng)用于臨床，其生物安全性是一個必須解決的關(guān)鍵問題。迄今為止，國際上尚未制定出一套用于納米材料評價特定的指導(dǎo)原則。多數(shù)納米醫(yī)藥制品的安全評價依然采用常規(guī)毒理學(xué)的評價指導(dǎo)原則。已有的研究表明，納米材料的尺寸形狀、表面電荷及其表面修飾等性質(zhì)均會對其生物學(xué)行為與生物效應(yīng)產(chǎn)生影響。近年來一些納米醫(yī)藥產(chǎn)品，經(jīng)常規(guī)毒理學(xué)評價定為無毒，但在使用過程中卻因為檢測到新的毒作用而被美國FDA撤出臨床。常規(guī)毒理學(xué)越來越不能適應(yīng)對納米生物醫(yī)藥制品安全評價的要求。制定一套客觀并能實時監(jiān)測納米顆粒在暴露過程中對機(jī)體可能得毒性作用的評價方法迫在眉睫，納米毒理學(xué)所肩負(fù)的任務(wù)任重而道遠(yuǎn)。 碳點是一種新型的熒光碳納米顆粒，，其粒徑一般在10nm以下，具有良好的分散性和熒光穩(wěn)定性。這種碳納米材料具有傳統(tǒng)熒光染料所不具備的諸多優(yōu)良性質(zhì)，如：熒光強(qiáng)度高、抗光漂白能力強(qiáng)、激發(fā)光譜連續(xù)等。此外，碳點具有很好的水溶性，其表面的羧基易于進(jìn)行生物偶聯(lián)與功能化修飾。碳點本身不含有任何有毒元素，與半導(dǎo)體量子點相比，展現(xiàn)出卓越的生物兼容性和環(huán)境友好性鑒于上述諸多優(yōu)良的理化性質(zhì)，碳點極具制備腫瘤診斷探針的潛質(zhì)，但是目前針對于碳點安全性評價的研究卻非常稀少，評價內(nèi)容也不全面、不系統(tǒng)，對碳點可能的毒性作用機(jī)制更是缺乏深入的研究。 本課題承接了國家973項目——“應(yīng)用納米技術(shù)解決胃癌預(yù)警與早期診斷中的關(guān)鍵科學(xué)問題”中碳點（一種用于標(biāo)記胃癌早期診斷探針的納米材料）對生物體的毒理效應(yīng)及其作用機(jī)制的評價研究任務(wù)，我們以國家食品藥品監(jiān)督管理局藥物評價指南為基礎(chǔ)和指導(dǎo)，參照國際化學(xué)物毒理學(xué)檢測指南對碳點的生物學(xué)效應(yīng)和致毒機(jī)制進(jìn)行了系統(tǒng)性評價。 研究內(nèi)容包括： (1)碳點的理化性質(zhì)表征。采用原子力顯微鏡、紫外可見光譜儀、熒光光度計等儀器分別對硝酸氧化法制備碳點的形貌、粒徑、吸收光譜、熒光光譜及熒光量子產(chǎn)率等參數(shù)進(jìn)行了表征。 (2)碳點的急性、亞急性毒性研究。分別選用BALB/C小鼠和Wistar大鼠，一次性尾靜脈注射染毒，記錄了受試動物在給藥后不同時間點一般狀況、食物利用率、體重、血液學(xué)、血清生化指標(biāo)的變化及主要臟器的病理改變。 (3)碳點的遺傳毒性評價。選用沙門氏菌回復(fù)突變試驗（受試菌株為鼠傷寒沙門氏菌TA97、TA98、TA100、TA102）、染色體畸變試驗、堿性單細(xì)胞凝膠電泳試驗及骨髓微核試驗四個組合試驗對碳點的致基因突變、染色體畸變和DNA損傷效應(yīng)進(jìn)行了測定。 (4)碳點對免疫功能的影響。選用BALB/C小鼠作為模式動物，以尾靜脈單次及多次注射的方式染毒，在給藥后多個時間點，采用脾細(xì)胞增殖試驗、淋巴細(xì)胞種類及亞群分析、巨噬細(xì)胞中性紅吞噬試驗、免疫相關(guān)細(xì)胞因子分泌及表達(dá)水平檢測、免疫器官病理形態(tài)分析等方法分別研究了碳點對小鼠巨噬細(xì)胞功能、T淋巴細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞增殖活性及其介導(dǎo)的免疫功能和相關(guān)免疫器官病理變化的影響。 試驗結(jié)果如下： (1)碳點的理化性質(zhì)表征結(jié)果表明，碳點的顆粒直徑在5～10nm，紫外、紅外光譜證實了碳點表面富含羧基和羥基基團(tuán)，從結(jié)構(gòu)上闡明了碳點具有很好的水溶性。熒光光譜分析表明碳點隨著激發(fā)光的不同可以發(fā)不同顏色的熒光，裸碳點在340nm激發(fā)，可以發(fā)射強(qiáng)的藍(lán)色熒光，其熒光量子產(chǎn)率在0.85%左右。 (2)碳點以單次靜脈注射方式染毒對模式動物沒有明顯的急性、亞急性毒性。動物的一般狀況良好；食物利用率、體重、血液學(xué)、血清生化指標(biāo)均沒有出現(xiàn)異常變化；主要臟器無明顯的病理改變。 (3)遺傳毒性組合試驗評價結(jié)果顯示，碳點在受試劑量內(nèi)不能誘導(dǎo)鼠傷寒沙門氏菌發(fā)生突變，對CHL細(xì)胞的染色體無致畸變作用，無明顯的DNA損傷效應(yīng)，不能誘發(fā)受試動物的骨髓紅細(xì)胞發(fā)生微核突變，說明碳點無明顯的遺傳毒性。 (4)免疫毒性研究結(jié)果表明，碳點尾靜脈注射單次染毒，在暴露早期，巨噬細(xì)胞被激活功能增強(qiáng)， IFN-γ等細(xì)胞因子的分泌水平增加，但未見淋巴細(xì)胞種群與數(shù)量的顯著變化，未誘發(fā)明顯的免疫效應(yīng)；但在染毒后第9天，碳點能顯著促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的活化增殖，提高IFN-γ與TNF-的分泌水平，增強(qiáng)Th1細(xì)胞介導(dǎo)的免疫效應(yīng)。碳點多次染毒，T淋巴細(xì)胞亦出現(xiàn)明顯增殖，IFN-γ與TNF-相關(guān)細(xì)胞因子分泌水平增加，且在基因水平的表達(dá)上調(diào)。碳點的持續(xù)暴露作用誘發(fā)了機(jī)體的氧化應(yīng)激損傷，破壞了機(jī)體的免疫平衡狀態(tài)，導(dǎo)致相關(guān)靶器官出現(xiàn)了可代償?shù)牟±聿∽儭?本論文立題于當(dāng)前極具挑戰(zhàn)的納米材料安全性研究方向，通過一系列分子、細(xì)胞和動物水平的試驗，首次對碳點的生物安全性做了較系統(tǒng)、全面地評價。一般毒性與遺傳毒性評價結(jié)果表明碳點在受試劑量內(nèi)沒有明顯的毒性作用；免疫毒性研究結(jié)果顯示，碳點在單次染毒時可以促進(jìn)Th1細(xì)胞介導(dǎo)的免疫效應(yīng)，但在多次給藥的情況下，碳點可誘發(fā)機(jī)體相關(guān)免疫器官發(fā)生可代償?shù)牟±聿∽儭Ｉ鲜鲈囼灲Y(jié)果為碳點在生物醫(yī)藥領(lǐng)域及臨床上的應(yīng)用奠定了安全性實驗基礎(chǔ)。
[Abstract]:The nano materials for biomarkers and diagnostic imaging, the application of nanometer technology in cancer medicine new research field, how to use the small size effect, unique nano material surface effect, quantum effect, optical, electrical, magnetic effect, biocompatibility properties to design good molecular probe to improve tumor diagnosis, tumor marker specific and the sensitivity of detection, is the medical oncology of nano technology put forward a challenge.
Nano materials for conversion of pharmaceutical products in clinical application, the biological safety is a key problem that must be solved. So far, the world has yet to develop a set of guidelines for the specific evaluation of nanometer materials. Most of the safety evaluation of pharmaceutical products is still using nano evaluation routine toxicology studies have shown that the guiding principle. The shape, size of nano materials, surface charge and surface modification properties will have an impact on the biological behavior and biological effects. In recent years, some nano pharmaceutical products, routine toxicological evaluation is non-toxic, but in the use of the process but because the detected toxic action by the United States and the new FDA clinical routine toxicology and withdrawal. Can not adapt to the evaluation of nano bio pharmaceutical products safety requirements. Develop a set of objective and real-time monitoring of nanoparticles may on the body during their exposure The evaluation of toxic effects is imminent, and the task of nanotoxicology is a long way to go.
Carbon is a new type of fluorescent carbon nanoparticles, the particle size is generally less than 10nm, with good dispersibility and stability of fluorescence. The carbon nano material has many excellent properties, the traditional fluorescent dyes do not have such as high fluorescence intensity, anti photobleaching ability, luminescence spectrum. In addition carbon, good water solubility, the surface carboxyl easy bioconjugation with functionalization. Carbon itself does not contain any toxic elements, compared with the semiconductor quantum dots exhibit excellent biological compatibility and environmental friendliness in view of many physical and chemical properties of the excellent, very little carbon preparation tumor diagnosis probe potential, but the current research for carbon safety evaluation of needle is very scarce, the evaluation content is not comprehensive, systematic, toxic effects on the mechanism of carbon potential is the lack of in-depth research.
This topic to undertake a national 973 project, "the application of nanotechnology to solve key scientific problems in early warning and early diagnosis of gastric cancer (a point in carbon nano materials used for early diagnosis of gastric cancer probe evaluation of toxicological effects on organisms) and the mechanism of the task, we use the State Food and drug Administration for drug evaluation guide for reference and reference to the biological effects of international guidelines on chemical toxicology testing point carbon and the toxic mechanism of the system of evaluation.
The research contents include:
(1) physical and chemical characterization of carbon dots. The morphology, particle size, absorption spectrum, fluorescence spectrum and fluorescence quantum yield of carbon dots were characterized by atomic force microscopy, UV VIS spectrometer and fluorometer.
(2) acute point carbon, subacute toxicity study. We used BALB/C mice and Wistar rats, intravenous injection were recorded in animal subjects administered at different time points after the general situation, food utilization rate, body weight, hematology, pathological changes of serum biochemical indexes and main organs.
(3) the genetic toxicity evaluation of carbon dots. Selected Salmonella reverse mutation test (test strains of Salmonella typhimurium TA97, TA98, TA100, TA102), chromosome aberration test, single cell gel electrophoresis test and micronucleus test of four combination test of carbon point gene mutation, chromosome aberration and DNA damage was measured.
(4) effects of carbon on the immune function. BALB/C mice were used as model animal, with tail vein single and multiple injection way exposure, after the administration of multiple time points, the spleen cell proliferation assay, cell type and subgroup analysis, macrophage phagocytosis of neutral red test, immune related cytokines and the expression level of detection, immune organ pathological analysis and other methods were studied carbon on macrophage function, affect the immune function of T lymphocytes and B lymphocytes proliferation and its mediated immune organs and related pathological changes.
The results of the test are as follows:
(1) characterization results show that carbon carbon, the particle diameter of 5 ~ 10nm, ultraviolet, infrared spectroscopy confirmed that the carbon rich surface carboxyl and hydroxyl groups from the structure to clarify the point carbon has good water solubility. The fluorescence spectrum analysis showed that carbon dots with fluorescence excitation can be different color emitting different, bare carbon at 340nm excitation, can emit strong blue fluorescence, the fluorescence quantum yield of around 0.85%.
(2) a single intravenous injection of carbon dots did not show acute and subacute toxicity to the model animals. The general condition of the animals was good. There was no abnormal change in food utilization, body weight, hematology and serum biochemical indexes. There was no obvious pathological change in the main organs.
(3) evaluate the genetic toxicity of combined test results show that the carbon in dose not induced by Salmonella typhimurium mutation on CHL cell chromosome aberration free, no obvious effect of DNA damage, unable to induce animal subjects bone marrow erythrocyte micronucleus mutation occurred, indicating no obvious genotoxicity of carbon.
(4) the immune toxicity results showed that carbon intravenous injection of single exposure, in the early exposure, enhance the function of macrophages are activated, the secretion level of IFN- gamma and other cytokines increased, but no significant changes in population and the number of lymphocytes, did not induce obvious immune effect; but in ninth days after exposure, carbon can significantly promote the proliferation and activation of T lymphocytes, improve the secretion level of IFN- gamma and TNF-, enhance the immune effect of Th1 cells mediated by carbon. Multiple exposure, T also appeared obvious lymphocyte proliferation, IFN- gamma and TNF- related cytokines secretion increased, and the level of expression of up-regulated genes. The effect of continuous exposure of carbon induced the oxidative stress injury, damage the immune balance of the body, resulting in target organs appeared pathological lesions can be compensated.
The direction of research on safety of nano materials to choose this subject to the current challenges, through a series of molecular, cellular and animal level test, for the first time the biological safety of carbon point to do a more comprehensive evaluation system, evaluation of general toxicity and genetic toxicity. The results indicate that the carbon in the subjects had no obvious toxicity dose; immune toxicity results showed that carbon can promote the immune response mediated by Th1 cells in a single exposure, but in the case of multiple dosing, carbon induced immune organ pathological lesions can be compensated. The results lay a foundation for the application of safety experiment in carbon the biological medicine field and clinic.

【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R114

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