本文選題：電離輻射　切入點：破骨細胞　出處：《蘇州大學》2012年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的：研究γ電離輻射對破骨細胞代謝的效應，并掌握相應的輻照劑量，初步探究其效應的機制。有利于進一步了解電離輻射改變骨代謝的途徑，為防治電離輻射所致的骨損害提供新的思路。 方法：本研究主要內(nèi)容包括四部分。第一部分研究2Gy γ射線全身單次輻照對小鼠體內(nèi)破骨細胞代謝和骨吸收的影響。C57BL/6雄性小鼠隨機分為對照組和輻照組。雙抗體夾心ELISA法測定輻照后不同時間點小鼠血清中骨代謝相關(guān)指標TRAP-5b、sRANKL、CTX-1和TNF-α；采用甲基百里香酚藍比色法測定血清中Ca~(2+)濃度；TRAP染色骨病理切片觀察破骨細胞形態(tài)變化。第二部分建立體外破骨細胞培養(yǎng)模型。通過使用小鼠重組sRANKL和轉(zhuǎn)移骨髓基質(zhì)細胞條件培養(yǎng)液兩種方法分別誘導破骨前體細胞株RAW264.7和骨髓單核細胞為破骨細胞。第三部分研究γ射線對RAW264.7細胞分化為破骨細胞的影響。在sRANKL誘導RAW264.7細胞分化為破骨細胞的過程中給予γ射線輻照，計數(shù)形成的破骨細胞數(shù)量和檢測破骨細胞代謝指標TRAP-5b，并用流式細胞術(shù)檢測輻照后細胞內(nèi)ROS和Ca~(2+)含量；第四部分研究γ射線對骨髓基質(zhì)細胞調(diào)控破骨細胞代謝的影響。不同劑量的γ射線全身單次照射C57BL/6雄性小鼠后第1、2、3和7天，使用一步法RT-PCR檢測骨髓細胞中RANKL mRNA和OPG mRNA。給予體外培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)細胞γ射線照射，ELISA法和共聚焦定量法檢測其RANKL蛋白的表達，并使用其條件培養(yǎng)液誘導骨髓單核細胞分化為破骨細胞。 結(jié)果：各部分對應的試驗結(jié)果如下： （1）輻照后第4天，與對照組相比，輻照組小鼠血清中TRAP-5b、CTX-1、sRANKL和TNF-α含量分別升高了37.30%、47.14%、19.55%和17.67%（P＜0.05），輻照組小鼠骨內(nèi)破骨細胞呈代謝活化相。輻照后第90天，輻照組小鼠血清TRAP-5b和CTX-1水平仍然要高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P0.01）。 （2）兩種方法均成功地誘導出由多個細胞互相融合形成的TRAP陽性多核破骨細胞。加入外源性的sRANKL刺激RAW264.7誘導出的破骨細胞比骨髓基質(zhì)細胞條件培養(yǎng)液刺激骨髓單核細胞形成的破骨細胞形態(tài)較大，數(shù)量也較多。 （3）1、2、4Gy輻照組破骨細胞數(shù)量與對照組相比增加，差異具有統(tǒng)計學意義（P0.001）；破骨細胞培養(yǎng)液中TRAP-5b的含量隨著輻照劑量的增加而升高，兩者呈正向直線線性相關(guān)（r~2=0.919，P=0.041）。輻照后，細胞內(nèi)ROS水平和Ca~(2+)水平均升高。 （4）輻照小鼠后3天，2、4和6Gy組的骨髓細胞RANKL/OPG mRNA比值與對照組相比明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P0.01），RANKL/OPG mRNA比值的改變依賴RANKL mRNA的變化。γ射線輻照后，骨髓基質(zhì)細胞的RANKL蛋白表達在輻照后早期增加。RANKL的表達升高具有劑量依賴性和時間依賴性，輻照劑量越大，RANKL升高得越早。輻照組骨髓基質(zhì)細胞條件培養(yǎng)液誘導形成的破骨細胞數(shù)量和TRAP-5b水平比對照組高，輻照劑量為2Gy時尤為明顯。 結(jié)論：2Gy的γ射線全身單次輻照可促進小鼠破骨細胞代謝，骨吸收增加，破骨細胞的代謝增強是電離輻照導致的骨損害的重要原因之一。γ射線促進破骨細胞代謝活化的機制包括如下： 1. γ射線通過升高破骨細胞活化的信號分子ROS和Ca~(2+)，以劑量依賴的方式促進破骨前體細胞分化形成破骨細胞； 2. γ射線以劑量和時間依賴的方式早期促進骨髓基質(zhì)細胞表達RANKL，輻照劑量越大，RANKL升高越早，，進而間接促進破骨細胞代謝活化，體外2Gy輻照時促進作用最為明顯； 3. γ射線輻照增加的TNF-α等炎癥因子，可能協(xié)同RANKL或直接促進破骨細胞代謝活化。
[Abstract]:Objective: To study the effect of gamma irradiation on the metabolism of osteoclasts, and to grasp the corresponding radiation dose, and preliminarily explore the mechanism of its effect. It is helpful for us to further understand the way of ionizing radiation to alter bone metabolism and provide new ideas for preventing and treating bone damage caused by ionizing radiation.
Methods: the main content of this study includes four parts. The first part of the study of 2Gy gamma ray irradiation effects on systemic single mice bone breaking metabolism and cellular uptake of.C57BL/6 male mice were randomly divided into control group and irradiation group. The determination of TRAP-5b serum markers of bone metabolism in mice at different time points after irradiation by double antibody sandwich ELISA sRANKL TNF-, CTX-1 and alpha; using methylthymol blue colorimetric method for the determination of Ca~ in serum (2+) concentration; bone pathological section to observe osteoclasts changes with TRAP staining. The second part is the establishment of in vitro osteoclast culture model. Through the use of recombinant mouse sRANKL and metastasis of bone marrow stromal cell conditioned medium induced by two methods were broken bone marrow mononuclear cells and RAW264.7 cells into osteoclasts. The third part of the study of gamma ray irradiation on the differentiation of RAW264.7 cells into osteoclast induced by RAW in sRANKL. 264.7 cell differentiation during osteoclast to gamma ray irradiation, the number of osteoclasts and counting the formation of osteoclast metabolism index of TRAP-5b were detected by flow cytometry after irradiation of intracellular ROS and Ca~ (2+) content; the fourth part is the study of gamma ray irradiation on bone marrow stromal cells regulate osteoclast metabolism. Different doses of gamma ray whole body single irradiation C57BL/6 male mice after 1,2,3 and 7 days, using one step RT-PCR for detection of RANKL in bone marrow cells of mRNA and OPG mRNA. with bone marrow stromal cells irradiated in vitro, the protein expression of RANKL was detected by ELISA method and confocal quantitative method, and its use conditions culture medium induced bone marrow mononuclear cells differentiated into osteoclasts.
Results: the results of the corresponding tests were as follows:
(1) fourth days after irradiation, compared with the control group, serum TRAP-5b, irradiated group mice CTX-1, sRANKL and TNF- were increased by 37.30%, 47.14%, 19.55% and 17.67% (P < 0.05), irradiated group mice bone osteoclasts showed metabolic activation. Ninetieth days after irradiation, irradiation in serum of mice TRAP-5b and CTX-1 levels are higher than the control group, the difference was statistically significant (P0.01).
(2) the two methods were successfully induced by multiple cells fused with each other to form TRAP positive multinucleated cells. Exogenous sRANKL stimulation of cultured bone marrow mononuclear cells to stimulate the formation of osteoclasts is larger than the conditions of bone marrow stromal cells of osteoclasts induced by RAW264.7, the number is more.
(3) 1,2,4Gy irradiation group the number of osteoclasts increased compared with the control group, the difference was statistically significant (P0.001); osteoclasts cultured in liquid TRAP-5b increased with the increase of radiation dose, showed a positive linear correlation between them (r~2=0.919, P=0.041). After irradiation, the level of ROS and Ca~ cells (2+) levels were elevated.
(4) 3 days after irradiation in mice, 2,4 and 6Gy group the bone marrow cells of RANKL/OPG mRNA ratio increased significantly compared with the control group, the difference was statistically significant (P0.01). The change of RANKL/OPG mRNA ratio change on RANKL mRNA. After irradiation, the expression of bone marrow stromal cells of RANKL in the early stage after irradiation increased.RANKL the expression increased with dose and time dependent manner, the higher the irradiation dose, RANKL increased sooner. Fluid induced the formation of osteoclast number and the level of TRAP-5b was higher than that of the control group irradiated bone marrow stromal cells cultured, irradiation at the dose of 2Gy is obvious.
Conclusion: the whole body single irradiation of 2Gy can promote the metabolism of rat osteoclasts, increase bone resorption and enhance the metabolism of osteoclasts. It is one of the important reasons for bone damage induced by ionizing radiation. The mechanism of promoting the activation of osteoclasts by gamma rays is as follows:
1. gamma rays can promote osteoclast to form osteoclasts in a dose dependent manner by increasing the activation of osteoclasts ROS and Ca~ (2+).
2. gamma rays promoted RANKL expression in bone marrow stromal cells in a dose and time dependent manner. The higher the radiation dose, the earlier the RANKL increased, which indirectly promoted the metabolic activation of osteoclasts. The effect of 2Gy irradiation was most obvious in vitro.
3. gamma ray irradiation increased TNF- alpha and other inflammatory factors, which may be synergistic with RANKL or direct the activation of osteoclast metabolism.

【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R144

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