本文選題：單增李斯特菌　切入點：環(huán)介導(dǎo)等溫擴增　出處：《華南理工大學(xué)》2012年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：單增李斯特菌為革蘭氏陽性桿菌，是重要食源性人獸共患病病原微生物，該菌可引起人和多種動物的李斯特菌病。世界衛(wèi)生組織已將其列為20世紀(jì)90年代四大食源性致病微生物之一。近年來世界范圍內(nèi)李斯特菌的發(fā)生有不斷上升趨勢，在食品中的污染廣泛存在。目前，檢測食品中單增李斯特菌傳統(tǒng)方法的操作繁瑣，，檢測周期長，通常需要4~7天，不能滿足食品中單增李斯特菌快速檢測的需要。因此需要建立一種快速、方便的單增李斯特菌的檢測方法。 2000年，Notomi T.等人研究開發(fā)出一種新的核酸擴增技術(shù)——環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（Loop-mediated isothermal amplification，簡稱LAMP）。該技術(shù)具有高特異性、高靈敏度、簡便快速和成本低的特點，已在病毒、細(xì)菌以及轉(zhuǎn)基因食品的檢測中得到應(yīng)用。 本研究以單增李斯特菌的hlyA基因作為靶基因，設(shè)計特異性引物，利用實時濁度監(jiān)測儀65℃保溫反應(yīng)60min。特異性實驗結(jié)果表明：LAMP法的特異性良好，能區(qū)分單增李斯特菌和其它食品中常見的細(xì)菌。靈敏度實驗結(jié)果表明：檢測該菌基因組DNA的靈敏度達92fg/反應(yīng)管，檢測該菌純培養(yǎng)物的靈敏度達13CFU/反應(yīng)管，檢測人工污染樣品的靈敏度達13CFU/反應(yīng)管，均比PCR法高出10倍；結(jié)合3h的前增菌，LAMP法能檢測出樣品中極低濃度的單增李斯特菌。檢測實際肉類樣品的實驗表明：與GB4789.30－2010培養(yǎng)方法比較，LAMP方法的符合率為96.67%，結(jié)合前增菌的LAMP方法的符合率為100%。 Calcein－Mn~(2+)作為一種新型指示劑，可以直接加到反應(yīng)液中，對LAMP擴增反應(yīng)的影響較少，最后顯色得出實驗結(jié)果與濁度儀指示結(jié)果一致。Calcein－Mn2+新型指示劑的開發(fā)和應(yīng)用，簡化了實驗操作流程，降低了實驗污染的概率。 本次研究所建立的LAMP方法能夠直接對食品樣品中的單增李斯特菌進行檢測，大約1h即可完成，與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法相比，大大縮短了檢測周期，為食品安全爭取了更為廣泛的時間范圍。
[Abstract]:Listeria monocytogenes (Listeria monocytogenes) is a Gram-positive bacillus and an important foodborne zoonotic microorganism. In 1990s, the World Health Organization has listed it as one of the four major foodborne pathogenic microorganisms. In recent years, the occurrence of Listeria sp. Has been increasing worldwide. Contamination is widespread in food. At present, the traditional method of detecting Listeria monocytogenes in food is cumbersome, and the detection period is long. It usually takes 4 to 7 days. It can not meet the need of rapid detection of Listeria monocytogenes in food, so it is necessary to establish a rapid and convenient method for the detection of Listeria monocytogenes. In 2000, Notomi T.et al developed a new nucleic acid amplification technique, Loop-mediated isothermal amplification, which is characterized by high specificity, high sensitivity, simplicity and low cost. The detection of bacteria and genetically modified foods has been applied. In this study, the hlyA gene of Listeria monocytogenes was used as the target gene, a specific primer was designed, and the real-time turbidity monitor was used to keep the temperature at 65 鈩

本文編號：1613581