本文選題：安化黑茶提取物　切入點：結(jié)直腸癌　出處：《中南林業(yè)科技大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：實驗?zāi)康慕陙?黑茶在茶葉市場中占有的份額越來越高,也得到了消費者的一致好評,原因主要有兩方面,一方面是黑茶的獨特口感和優(yōu)良品質(zhì),另一方面是其具有很好的保健功能。黑茶的保健功效主要有降脂、抗氧、抗癌和調(diào)節(jié)腸道免疫功能等。隨著全球癌癥發(fā)病率的不斷攀升,抗癌作用已成為黑茶功能研究的熱點。我省有著豐富的安化黑茶資源,研究安化黑茶提取物的抗癌功能可以極大地提高其附加值,本實驗以結(jié)直腸癌細胞作為實驗?zāi)Ｐ?對安化黑茶的抗癌功能進行評估并探討其作用的分子機理,為日后人們的飲食、功能性食品、保健產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)。實驗方法本課題擬從黑茶提取物抑制結(jié)直腸癌細胞增殖和促使結(jié)直腸癌細胞凋亡兩個方面對黑茶抗癌功能進行評估。利用MTS方法,分析安化黑茶提取物對結(jié)直腸癌細胞HCT116增殖的影響;利用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)分析黑茶提取物對癌細胞相關(guān)基因表達的影響;采用報道基因系統(tǒng)確定黑茶提取物對轉(zhuǎn)錄因子AP-1和NF-κB活性的影響;采用磷酸化抗體分析黑茶提取物對MAPK信號通路的影響等。通過HOechst33258熒光染色法分析黑茶提取物對結(jié)直腸癌細胞調(diào)亡的影響,確定其對細胞形態(tài)、細胞核的變化;通過流式細胞技術(shù)進一步分析安化黑茶提取物對結(jié)直腸癌細胞調(diào)亡的影響;采用Western blot方法,分析安化黑茶提取物對Bcl-2家族蛋白和Caspase活化的影響。闡明安化黑茶提取物抑制直腸癌細胞增殖和促進凋亡的分子機理。實驗結(jié)果(1)安化黑茶提取物對結(jié)直腸癌細胞增殖具有抑制作用。本課題首先采用MTS細胞存活實驗分析了安化黑茶提取物對結(jié)直腸癌細胞HCT116增殖的影響,采用0 μg/mL、100 μg/mL、200μg/mL和400μg/mL濃度安化黑茶提取物作用48 h后,發(fā)現(xiàn)安化黑茶提取物能抑制HCT116的增殖活動,且隨著濃度增大,抑制作用增強。(2)安化黑茶提取物能調(diào)控細胞周期關(guān)鍵靶基因的表達安化黑茶提取物處理結(jié)直腸癌細胞,提取總RNA,通過實時熒光定量PCR(qRT-PCR)發(fā)現(xiàn),安化黑茶提取物能抑制細胞周期關(guān)鍵靶基因cyclinD1和VEGF的mRNA表達水平,且呈劑量依賴性的關(guān)系。細胞周期素依賴的蛋白激酶抑制子(CDKI)與癌細胞的增殖密切相關(guān)。實驗發(fā)現(xiàn)安化黑茶提取物對p16、p21、p27和p53均具有明顯的提升作用,且呈劑量依賴性,提示安化黑茶提取物能抑制CDK2/CDK4/CyclinD復(fù)合物的活性,抑制結(jié)直腸癌細胞的增殖。但安化黑茶提取物對p15、p18和p19的表達沒有影響。(3)安化黑茶提取物對結(jié)直腸癌細胞AP-1和NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的影響轉(zhuǎn)錄因子AP-1和NF-κB在癌的發(fā)生、發(fā)展中起非常重要的作用。在P16、p21、p27、p53、cyclinD1和VEGF等基因的啟動子區(qū)域,均存在AP-1和NF-κB的DNA結(jié)合位點,AP-1和NF-κB是調(diào)控CDKI基因表達的重要轉(zhuǎn)錄因子,同時,也是cyclinD1基因的表達的主要調(diào)控因子。將帶有熒光素酶的AP-1和NF-κB報道質(zhì)粒通過Lipofectamin 2000導(dǎo)入HCT116細胞,不同安化黑茶提取物處理結(jié)直腸癌細胞后,檢測熒光酶的活性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)安化黑茶提取物既能抑制轉(zhuǎn)錄因子AP-1的活性,也能抑制轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活性,提示安化黑茶提取物可能通過抑制AP-1和NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性,從而下調(diào)對cyclin D1和VEGF等表達,提升對p16、p21、p27和p53等的表達。(4)安化黑茶提取物對結(jié)直腸癌細胞MAPK信號通路的影響MAPK信號通路是癌細胞中異�；罨男盘柾�,與癌細胞的增殖和凋亡密切相關(guān)。轉(zhuǎn)錄因子AP-1和NF-κB是MAPK下游激活的靶蛋白,如JNK能直接活化c-Jun,從而激活A(yù)P-1。不同安化黑茶提取物處理結(jié)直腸癌細胞后,提取總蛋白Western blot分析發(fā)現(xiàn),安化黑茶提取物能抑制ERK1/2和JNK的磷酸化,且呈劑量依賴性的關(guān)系;相反,安化黑茶提取物能促使P38MAPK的磷酸化。結(jié)果提示安化黑茶提取物能抑制癌細胞增殖的信號通路,同時,也能激活與癌細胞凋亡相關(guān)的信號通路。(5)安化黑茶提取物促進結(jié)直腸癌細胞凋亡不同濃度的黑茶提取物處理結(jié)直腸癌細胞后,結(jié)果發(fā)現(xiàn),低濃度的黑茶提取物不能導(dǎo)致結(jié)直腸癌細胞HCT116凋亡,高濃度黑茶提取物能顯著促進結(jié)直腸癌細胞凋亡,在熒光染色實驗中發(fā)現(xiàn)有細胞核凝集、濃縮、核碎裂,出現(xiàn)凋亡小體等,通過流式細胞儀進一步證實黑茶提取物能促進結(jié)直腸癌細胞凋亡。(6)安化黑茶提取物對結(jié)直腸癌細胞凋亡相關(guān)基因表達的影響B(tài)cl-2超家族對于維持細胞的穩(wěn)態(tài)非常重要,Bcl-2超家族既包含有促細胞調(diào)亡的蛋白如Bax,也包括抑制細胞調(diào)亡的蛋白如Bcl-2。不同濃度的黑茶提取物處理結(jié)直腸癌細胞后,Western blot分析發(fā)現(xiàn)黑茶提取物能促進Bax基因表達,同時,抑制Bcl-2基因表達,黑茶提取物打破了 Bax/Bcl-2比例,促進結(jié)直腸癌細胞凋亡,導(dǎo)致Caspase-3活化。結(jié)論:基于以上實驗研究,本課題確定了安化黑茶提取物能抑制結(jié)直腸癌細胞增殖,其分子機理:安化黑茶提取物→MAPK表達↓→AP-1、NF-κB↓→cyclinD1↓、VEGF↓、CDKI表達↑→細胞周期阻滯→抑制癌細胞增殖。本課題確定了安化黑茶提取物能促進結(jié)直腸癌細胞凋亡,其可能的分子機理:安化黑茶提取物→Bcl-2表達↓、Bax表達↑→Caspase-3活化→結(jié)直腸癌細胞凋亡。
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【學(xué)位授予單位】：中南林業(yè)科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R151;TS272.5
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本文編號：1608680