本文選題：安化黑茶提取物　切入點(diǎn)：結(jié)直腸癌　出處：《中南林業(yè)科技大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：實(shí)驗(yàn)?zāi)康慕陙?黑茶在茶葉市場中占有的份額越來越高,也得到了消費(fèi)者的一致好評,原因主要有兩方面,一方面是黑茶的獨(dú)特口感和優(yōu)良品質(zhì),另一方面是其具有很好的保健功能。黑茶的保健功效主要有降脂、抗氧、抗癌和調(diào)節(jié)腸道免疫功能等。隨著全球癌癥發(fā)病率的不斷攀升,抗癌作用已成為黑茶功能研究的熱點(diǎn)。我省有著豐富的安化黑茶資源,研究安化黑茶提取物的抗癌功能可以極大地提高其附加值,本實(shí)驗(yàn)以結(jié)直腸癌細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?對安化黑茶的抗癌功能進(jìn)行評估并探討其作用的分子機(jī)理,為日后人們的飲食、功能性食品、保健產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)。實(shí)驗(yàn)方法本課題擬從黑茶提取物抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和促使結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡兩個(gè)方面對黑茶抗癌功能進(jìn)行評估。利用MTS方法,分析安化黑茶提取物對結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116增殖的影響;利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)分析黑茶提取物對癌細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的影響;采用報(bào)道基因系統(tǒng)確定黑茶提取物對轉(zhuǎn)錄因子AP-1和NF-κB活性的影響;采用磷酸化抗體分析黑茶提取物對MAPK信號(hào)通路的影響等。通過HOechst33258熒光染色法分析黑茶提取物對結(jié)直腸癌細(xì)胞調(diào)亡的影響,確定其對細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞核的變化;通過流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)一步分析安化黑茶提取物對結(jié)直腸癌細(xì)胞調(diào)亡的影響;采用Western blot方法,分析安化黑茶提取物對Bcl-2家族蛋白和Caspase活化的影響。闡明安化黑茶提取物抑制直腸癌細(xì)胞增殖和促進(jìn)凋亡的分子機(jī)理。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(1)安化黑茶提取物對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖具有抑制作用。本課題首先采用MTS細(xì)胞存活實(shí)驗(yàn)分析了安化黑茶提取物對結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116增殖的影響,采用0 μg/mL、100 μg/mL、200μg/mL和400μg/mL濃度安化黑茶提取物作用48 h后,發(fā)現(xiàn)安化黑茶提取物能抑制HCT116的增殖活動(dòng),且隨著濃度增大,抑制作用增強(qiáng)。(2)安化黑茶提取物能調(diào)控細(xì)胞周期關(guān)鍵靶基因的表達(dá)安化黑茶提取物處理結(jié)直腸癌細(xì)胞,提取總RNA,通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)發(fā)現(xiàn),安化黑茶提取物能抑制細(xì)胞周期關(guān)鍵靶基因cyclinD1和VEGF的mRNA表達(dá)水平,且呈劑量依賴性的關(guān)系。細(xì)胞周期素依賴的蛋白激酶抑制子(CDKI)與癌細(xì)胞的增殖密切相關(guān)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)安化黑茶提取物對p16、p21、p27和p53均具有明顯的提升作用,且呈劑量依賴性,提示安化黑茶提取物能抑制CDK2/CDK4/CyclinD復(fù)合物的活性,抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖。但安化黑茶提取物對p15、p18和p19的表達(dá)沒有影響。(3)安化黑茶提取物對結(jié)直腸癌細(xì)胞AP-1和NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的影響轉(zhuǎn)錄因子AP-1和NF-κB在癌的發(fā)生、發(fā)展中起非常重要的作用。在P16、p21、p27、p53、cyclinD1和VEGF等基因的啟動(dòng)子區(qū)域,均存在AP-1和NF-κB的DNA結(jié)合位點(diǎn),AP-1和NF-κB是調(diào)控CDKI基因表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄因子,同時(shí),也是cyclinD1基因的表達(dá)的主要調(diào)控因子。將帶有熒光素酶的AP-1和NF-κB報(bào)道質(zhì)粒通過Lipofectamin 2000導(dǎo)入HCT116細(xì)胞,不同安化黑茶提取物處理結(jié)直腸癌細(xì)胞后,檢測熒光酶的活性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)安化黑茶提取物既能抑制轉(zhuǎn)錄因子AP-1的活性,也能抑制轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活性,提示安化黑茶提取物可能通過抑制AP-1和NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性,從而下調(diào)對cyclin D1和VEGF等表達(dá),提升對p16、p21、p27和p53等的表達(dá)。(4)安化黑茶提取物對結(jié)直腸癌細(xì)胞MAPK信號(hào)通路的影響MAPK信號(hào)通路是癌細(xì)胞中異�；罨男盘�(hào)通路,與癌細(xì)胞的增殖和凋亡密切相關(guān)。轉(zhuǎn)錄因子AP-1和NF-κB是MAPK下游激活的靶蛋白,如JNK能直接活化c-Jun,從而激活A(yù)P-1。不同安化黑茶提取物處理結(jié)直腸癌細(xì)胞后,提取總蛋白Western blot分析發(fā)現(xiàn),安化黑茶提取物能抑制ERK1/2和JNK的磷酸化,且呈劑量依賴性的關(guān)系;相反,安化黑茶提取物能促使P38MAPK的磷酸化。結(jié)果提示安化黑茶提取物能抑制癌細(xì)胞增殖的信號(hào)通路,同時(shí),也能激活與癌細(xì)胞凋亡相關(guān)的信號(hào)通路。(5)安化黑茶提取物促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡不同濃度的黑茶提取物處理結(jié)直腸癌細(xì)胞后,結(jié)果發(fā)現(xiàn),低濃度的黑茶提取物不能導(dǎo)致結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116凋亡,高濃度黑茶提取物能顯著促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡,在熒光染色實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)有細(xì)胞核凝集、濃縮、核碎裂,出現(xiàn)凋亡小體等,通過流式細(xì)胞儀進(jìn)一步證實(shí)黑茶提取物能促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡。(6)安化黑茶提取物對結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響B(tài)cl-2超家族對于維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)非常重要,Bcl-2超家族既包含有促細(xì)胞調(diào)亡的蛋白如Bax,也包括抑制細(xì)胞調(diào)亡的蛋白如Bcl-2。不同濃度的黑茶提取物處理結(jié)直腸癌細(xì)胞后,Western blot分析發(fā)現(xiàn)黑茶提取物能促進(jìn)Bax基因表達(dá),同時(shí),抑制Bcl-2基因表達(dá),黑茶提取物打破了 Bax/Bcl-2比例,促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡,導(dǎo)致Caspase-3活化。結(jié)論:基于以上實(shí)驗(yàn)研究,本課題確定了安化黑茶提取物能抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖,其分子機(jī)理:安化黑茶提取物→MAPK表達(dá)↓→AP-1、NF-κB↓→cyclinD1↓、VEGF↓、CDKI表達(dá)↑→細(xì)胞周期阻滯→抑制癌細(xì)胞增殖。本課題確定了安化黑茶提取物能促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡,其可能的分子機(jī)理:安化黑茶提取物→Bcl-2表達(dá)↓、Bax表達(dá)↑→Caspase-3活化→結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡。
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【學(xué)位授予單位】：中南林業(yè)科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R151;TS272.5
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本文編號(hào)：1608680