本文選題：鄰苯二甲酸二丁酯　切入點：生精細胞凋亡　出處：《第三軍醫(yī)大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：研究背景:鄰苯二甲酸酯類(Phthalic acid esters,PAEs)是一類工業(yè)上大量生產(chǎn)的有機化合物。大部分PAEs以增塑劑的形式用于塑料制品中,同時也在化妝品、洗滌劑、農(nóng)藥、油漆、涂料等消費品中廣泛使用。PAEs與塑料分子通常以非共價鍵形式結(jié)合,在特定條件下容易出現(xiàn)解離,進入周圍的空氣、土壤和水環(huán)境中,通過呼吸道、消化道或皮膚沾染的方式進入機體。因此,除了職業(yè)人群,普通人群也可通過多種途徑接觸PAEs,進而引起健康損害。研究表明,睪丸是PAEs最主要的靶器官,人群流行病學和實驗研究均已證實PAEs暴露具有雄性生殖毒性。最近的動物實驗研究顯示,生精細胞凋亡可能是PAEs導致的雄性生殖毒性最主要的特征—睪丸萎縮的潛在機制。然而,PAEs誘導生精細胞凋亡的的分子事件及相關(guān)的分子信號通路仍然不十分清楚。近年來研究報道顯示PAEs可以導致睪丸氧化性損傷和生殖細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張及線粒體水腫,提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體氧化性損傷可能是其誘導生殖細胞凋亡的潛在分子機制。因此,本課題使用鄰苯二甲酸二丁酯(Dibutyl phthalate,DBP)作為PAEs的代表化學物,在明確DBP可誘導睪丸生精細胞凋亡的條件下,研究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(Endoplasmic reticulum stress,ER stress)、線粒體損傷在DBP致雄性生殖毒性過程中的作用及機制,并進一步以我們建立的重慶大學生生殖健康(Male Reproductive Health in Chongqing College Students,MARHCS)隊列人群為基礎(chǔ),驗證PAEs引起的線粒體損傷效應。研究內(nèi)容:1.DBP誘導生精細胞凋亡過程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和自噬作用的研究建立小鼠生精細胞來源的GC-2細胞體外染毒模型,以CCK-8方法評價DBP對細胞的毒性效應;以Annexin V/PI染色檢測DBP對細胞凋亡的影響。采用Western blot檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)蛋白標志物GRP78、p-e IF2α和ATF6的表達,以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)的凋亡標志物p-JNK/p-p38、CHOP和Caspase-12的表達;進一步采用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激抑制劑4-PBA預處理細胞,研究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激在DBP誘導的生精細胞凋亡中的作用。采用電鏡觀察DBP處理的GC-2細胞內(nèi)自噬小體的水平;Western blot檢測自噬標志蛋白lc-3和p62的變化;進一步采用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激抑制劑4-pba和自噬特異性抑制劑3-ma預處理細胞,研究細胞自噬在dbp誘導的生精細胞凋亡中的作用。此外,建立前青春期雄性大鼠的dbp染毒動物模型,通過體內(nèi)實驗驗證dbp對生精細胞的毒性效應及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的作用2.dbp誘導生精細胞凋亡過程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導的自噬分子機制研究采用細胞自噬抑制劑氯喹(cq)預處理細胞,進一步驗證dbp激活自噬是否由于增加了gc-2細胞內(nèi)的自噬流。進一步通過檢測p-eif2α/atf4/atg12、mtor以及ire1α/jnk/beclin1通路中蛋白分子表達水平的變化,明確dbp誘導細胞自噬的分子通路。此外,檢測dbp對gc-2細胞內(nèi)ros的影響,同時采用抗氧化劑褪黑激素(melatonin)預處理細胞,研究細胞氧化應激在dbp誘導的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和自噬的作用。3.perk激活的nrf2/are通路在dbp引起的線粒體損傷中作用的研究通過檢測線粒體質(zhì)量、mtdna拷貝數(shù)、atp水平,以及cytc的釋放和caspase的活化,研究dbp對gc-2細胞的線粒體損傷及線粒體通路細胞凋亡的激活;進一步采用抗氧化劑melatonin預處理細胞,明確dbp誘導的氧化應激在線粒體損傷的作用。此外,檢測抗氧化通路nrf2/are的激活狀態(tài)及其與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)通路perk的關(guān)系,并分別采用perk和nrf2抑制劑預處理細胞,研究perk與nrf2/are通路之間的關(guān)系,以及nrf2/are抗氧化通路在dbp誘導的線粒體損傷中的作用。4.人群paes暴露對精子線粒體功能和mtdna結(jié)構(gòu)的影響本課題組于2013年建立了“重慶市大學生男性生殖健康調(diào)查(malereproductivehealthinchongqingcollegestudent,marhcs)隊列”,目的是研究社會-心理-行為因素和環(huán)境有害因素對男性生殖健康的影響。在2014年第一次人群隨訪階段,本研究建立了反映人精子線粒體功能的線粒體膜電位(mmp)檢測方法,以及反映線粒體dna結(jié)構(gòu)改變的mtdna拷貝數(shù)與完整性的檢測方法;進一步分析了精子線粒體相關(guān)指標與精液質(zhì)量參數(shù)的相關(guān)性,同時研究個體尿液paes內(nèi)暴露水平與精液參數(shù)及精子線粒體指標的關(guān)聯(lián)。通過人群研究進一步驗證paes對生精過程的線粒體損傷作用。研究結(jié)果:1.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激通過激活自噬對抗dbp誘導的生精細胞凋亡結(jié)果顯示,dbp對gc-2細胞有明顯的毒性效應,并可誘導生精細胞凋亡,存在劑量-效應關(guān)系。dbp在低劑量水平即可提高細胞內(nèi)grp78、p-eif2α和atf6等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激蛋白標志物的水平,提示dbp可誘導生精細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激;此外,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激抑制劑4-pba可加重dbp誘導的生精細胞凋亡,提示激活的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激在dbp的生殖毒性中起保護性作用。進一步研究發(fā)現(xiàn),dbp顯著增加gc-2細胞內(nèi)的自噬水平,而4-pba預處理可明顯抑制細胞自噬的發(fā)生,提示dbp誘導的細胞自噬是由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激所介導;同時,自噬抑制劑3-ma預處理可明顯加重dbp誘導的gc-2細胞凋亡,提示細胞自噬在dbp的生殖毒性中起保護作用。體內(nèi)動物實驗進一步證實,dbp能明顯誘導睪丸生精細胞凋亡;4-pba可降低dbp誘導的睪丸細胞自噬,并且4-pba和3-ma處理均加重了dbp對睪丸的損傷。上述結(jié)果提示,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激通過激活自噬對抗dbp誘導的生精細胞凋亡及睪丸損傷。2.p-eif2α/atf4/atg12通路介導了dbp誘導的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)的自噬研究顯示,氯喹處理可增強dbp誘導的細胞自噬蛋白lc3-ii的表達,提示dbp誘導gc-2細胞自噬水平升高是由于自噬流的增加。細胞自噬分子機制研究表明,mtor通路和jnk/beclin1通路相關(guān)蛋白未發(fā)生明顯改變,而p-eif2α/atf4通過調(diào)節(jié)atg12的表達,介導了dbp誘導的生精細胞自噬。進一步的實驗發(fā)現(xiàn),dbp能顯著增加gc-2細胞內(nèi)的ros水平,而抗氧化劑melatonin預處理可明顯抑制ros水平的增加,并降低dbp誘導的gc-2細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和自噬,提示氧化應激可能參與dbp誘導的生精細胞異常改變。3.perk激活nrf2/are抗氧化通路對抗dbp誘導的生精細胞線粒體損傷dbp處理可誘導gc-2細胞線粒體質(zhì)量下降、mtdna拷貝數(shù)降低和atp合成下降,并且明顯誘導線粒體途徑的細胞凋亡,而抗氧化劑melatonin可降低dbp誘導的線粒體損傷和凋亡。進一步研究發(fā)現(xiàn),dbp激活了細胞內(nèi)nrf2/are抗氧化反應通路,而nrf2sirna預處理后,可顯著加重dbp誘導的細胞線粒體損傷和凋亡。此外,采用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)分子perk的特異性抑制劑處理后,nrf2/are抗氧化通路的活化水平下降,并且加重了dbp誘導的細胞線粒體損傷。體內(nèi)動物實驗進一步證實,perk抑制劑處理可降低睪丸組織中nrf2/are通路的激活,并加重dbp誘導的睪丸生精細胞線粒體途徑的凋亡。4.人群paes暴露對精子線粒體功能和mtdna結(jié)構(gòu)的影響人群研究表明,精子線粒體的膜電位、mtdna拷貝數(shù)和mtdna完整性與精液質(zhì)量參數(shù)密切相關(guān),提示上述線粒體相關(guān)指標可能成為反映精液質(zhì)量的生物標志物。分析進一步發(fā)現(xiàn),尿液中paes代謝物mep、mnbp和mcpp水平與精子前向活力呈明顯的負相關(guān),mehp水平與線粒體膜電位正相關(guān),高暴露dehp或尿中mchp、mnop、mbzp和minp單酯水平高的人群mtdna完整性明顯較差,提示人精子的線粒體可能是PAEs致男性生殖損傷的一個靶。研究結(jié)論:DBP可誘導睪丸毒性、生精細胞的氧化應激及線粒體途徑的凋亡,同時,DBP也激活細胞內(nèi)的自我防護機制—內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激,一方面通過p-eIF2α/ATF4/Atg12通路激活細胞自噬,另一方面通過PERK信號激活Nrf2/ARE抗氧化通路,對抗DBP引起的生精細胞凋亡。人群研究發(fā)現(xiàn),個體的PAEs尿中代謝物水平與精子mt DNA完整性降低顯著相關(guān),進一步證實了PAEs化學物可造成生殖細胞的線粒體損傷及相應的生殖毒性,并提示線粒體相關(guān)的指標可以作為反映男性生殖能力的生物標志物。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R114

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本文編號：1597369