本文選題：雄性生殖毒性　切入點：綠色熒光蛋白　出處：《吉林大學(xué)》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目前,環(huán)境化合物、藥物、毒物中有許多外源化學(xué)物質(zhì)對動物及人類的雄性生殖系統(tǒng)具有潛在的危害,動物模型可以代替人類評估這些物質(zhì)對雄性生殖系統(tǒng)的損傷作用。傳統(tǒng)的雄性生殖毒理學(xué)實驗投入成本大、用時時間長、受試動物多、不能在體實時動態(tài)觀察到生殖系統(tǒng)的損傷。理想的動物模型和先進的實驗技術(shù)有助于克服傳統(tǒng)雄性生殖毒理學(xué)實驗的缺點。熒光報告蛋白發(fā)現(xiàn)于60年代,作為分子標(biāo)簽被廣泛應(yīng)用于研究細胞和分子的功能及相互作用。近幾年,熒光報告蛋白的活體熒光體內(nèi)成像技術(shù)迅速發(fā)展,特別是具有諸多優(yōu)點的綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein,GFP),其在較為簡單的成像系統(tǒng)下即可完成體內(nèi)成像。綠色熒光蛋白(GFP)是否可用于生殖毒物活體篩選與毒性評估呢?目前相關(guān)研究報道較少。本課題的主要研究內(nèi)容是利用Cre-lox P基因重組系統(tǒng)制作雄性生殖細胞特異性表達GFP小鼠模型。利用常見的雄性生殖系統(tǒng)毒物乙二醇單甲醚(Ethylene glycol monomethyl ether,EGME)對此模型小鼠進行染毒處理。以睪丸組織綠色熒光強度作為毒性觀察指標(biāo),并與常規(guī)毒理學(xué)指標(biāo)進行比較,以探討模型小鼠在雄性生殖毒理學(xué)的應(yīng)用。1、F1代雄性小鼠基因型鑒定生殖細胞特異性表達Cre酶轉(zhuǎn)基因雄鼠(Ddx4-Cre,雜合子—T/W)與具有l(wèi)ox P序列的雙熒光報告轉(zhuǎn)基因雌鼠(Rosa26m T/m G,純合子—mut/mut)交配獲得F1代雄性小鼠,其進行基因鑒定后可分成兩種基因型:cre(T/W);m T/m G(mut/wt)—雙轉(zhuǎn)基因小鼠和cre(W/W);m T/m G(mut/wt)—單轉(zhuǎn)基因小鼠。2、F1代雄性小鼠表型鑒定對這兩種不同基因型的F1代雄性小鼠進行表型研究。基因檢測發(fā)現(xiàn)雙轉(zhuǎn)基因F1代小鼠的生殖細胞特異性的發(fā)生了Cre酶介導(dǎo)的lox P序列間基因重組;利用小動物成像儀觀察組織熒光發(fā)現(xiàn)GFP特異性表達在雙轉(zhuǎn)基因小鼠睪丸組織;組織冰凍切片的DAPI染色和精子熒光觀察結(jié)果顯示雙轉(zhuǎn)基因F1代小鼠睪丸組織中綠色熒光蛋白主要表達在生精小管,集中在精母細胞、精子細胞和精子中。因此雄性生殖系統(tǒng)特異性表達GFP小鼠模型制作成功。3、雄性生殖細胞特異性表達GFP小鼠的EGME染毒實驗SPF級雄性生殖細胞特異性表達GFP小鼠8~9周,20只,按照體重隨機分成2組,分別設(shè)為用藥組和對照組。采用灌胃方式進行染毒,用藥組小鼠按0.1ml/10g的劑量給予25mg/ml EGME溶液,對照組給予相同劑量的生理鹽水。兩組動物染毒后分兩個階段—用藥11天和用藥34天,從活體器官、離體組織和細胞水平觀察小鼠睪丸綠色熒光強度變化并進行常規(guī)毒理學(xué)實驗指標(biāo)的采集。常規(guī)的毒理學(xué)指標(biāo)顯示:用藥組小鼠睪丸重量與對照組小鼠睪丸重量相比明顯減小;睪丸組織HE染色觀察顯示用藥11天時小鼠精母細胞大量減少,用藥34天時小鼠的精母細胞和精子細胞基本消失,同時睪丸正常結(jié)構(gòu)被破壞。觀察睪丸熒光強度結(jié)果顯示:活體睪丸綠色熒光在用藥34天時基本消失;用藥11天與用藥34天小鼠離體睪丸的熒光強度均低于對照組;因GFP主要表達在睪丸中的精母細胞和精子細胞,這在器官水平上就說明了乙二醇單甲醚可能影響了小鼠睪丸細胞中的精母細胞和精子細胞;睪丸組織切片熒光觀察顯示在用藥11天時小鼠睪丸組織中精母細胞的綠色熒光基本消失,而在靠近生精小管管腔部位的精子細胞中仍然可以觀察到綠色熒光,在用藥34天時小鼠的精母細胞和精子細胞中綠色熒光均消失,這說明精母細胞是EGME的靶細胞。睪丸綠色熒光觀察結(jié)果與睪丸重量檢測和病理學(xué)觀察結(jié)果相符。利用Cre-lox P系統(tǒng)成功制備了雄性生殖細胞特異性表達GFP小鼠模型,并用EGME給予驗證。此模型小鼠可以在器官水平上觀察毒性作用的靶細胞,能實時動態(tài)的觀察生殖系統(tǒng)的變化,可減少實驗動物使用量、縮短試驗時間,為開發(fā)雄性生殖毒理學(xué)研究中的動物模型和實驗技術(shù)奠定基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R114

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本文編號：1591484