本文選題：雄性生殖毒性　切入點(diǎn)：綠色熒光蛋白　出處：《吉林大學(xué)》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目前,環(huán)境化合物、藥物、毒物中有許多外源化學(xué)物質(zhì)對(duì)動(dòng)物及人類的雄性生殖系統(tǒng)具有潛在的危害,動(dòng)物模型可以代替人類評(píng)估這些物質(zhì)對(duì)雄性生殖系統(tǒng)的損傷作用。傳統(tǒng)的雄性生殖毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)投入成本大、用時(shí)時(shí)間長、受試動(dòng)物多、不能在體實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀察到生殖系統(tǒng)的損傷。理想的動(dòng)物模型和先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)有助于克服傳統(tǒng)雄性生殖毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)的缺點(diǎn)。熒光報(bào)告蛋白發(fā)現(xiàn)于60年代,作為分子標(biāo)簽被廣泛應(yīng)用于研究細(xì)胞和分子的功能及相互作用。近幾年,熒光報(bào)告蛋白的活體熒光體內(nèi)成像技術(shù)迅速發(fā)展,特別是具有諸多優(yōu)點(diǎn)的綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein,GFP),其在較為簡單的成像系統(tǒng)下即可完成體內(nèi)成像。綠色熒光蛋白(GFP)是否可用于生殖毒物活體篩選與毒性評(píng)估呢?目前相關(guān)研究報(bào)道較少。本課題的主要研究內(nèi)容是利用Cre-lox P基因重組系統(tǒng)制作雄性生殖細(xì)胞特異性表達(dá)GFP小鼠模型。利用常見的雄性生殖系統(tǒng)毒物乙二醇單甲醚(Ethylene glycol monomethyl ether,EGME)對(duì)此模型小鼠進(jìn)行染毒處理。以睪丸組織綠色熒光強(qiáng)度作為毒性觀察指標(biāo),并與常規(guī)毒理學(xué)指標(biāo)進(jìn)行比較,以探討模型小鼠在雄性生殖毒理學(xué)的應(yīng)用。1、F1代雄性小鼠基因型鑒定生殖細(xì)胞特異性表達(dá)Cre酶轉(zhuǎn)基因雄鼠(Ddx4-Cre,雜合子—T/W)與具有l(wèi)ox P序列的雙熒光報(bào)告轉(zhuǎn)基因雌鼠(Rosa26m T/m G,純合子—mut/mut)交配獲得F1代雄性小鼠,其進(jìn)行基因鑒定后可分成兩種基因型:cre(T/W);m T/m G(mut/wt)—雙轉(zhuǎn)基因小鼠和cre(W/W);m T/m G(mut/wt)—單轉(zhuǎn)基因小鼠。2、F1代雄性小鼠表型鑒定對(duì)這兩種不同基因型的F1代雄性小鼠進(jìn)行表型研究。基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)雙轉(zhuǎn)基因F1代小鼠的生殖細(xì)胞特異性的發(fā)生了Cre酶介導(dǎo)的lox P序列間基因重組;利用小動(dòng)物成像儀觀察組織熒光發(fā)現(xiàn)GFP特異性表達(dá)在雙轉(zhuǎn)基因小鼠睪丸組織;組織冰凍切片的DAPI染色和精子熒光觀察結(jié)果顯示雙轉(zhuǎn)基因F1代小鼠睪丸組織中綠色熒光蛋白主要表達(dá)在生精小管,集中在精母細(xì)胞、精子細(xì)胞和精子中。因此雄性生殖系統(tǒng)特異性表達(dá)GFP小鼠模型制作成功。3、雄性生殖細(xì)胞特異性表達(dá)GFP小鼠的EGME染毒實(shí)驗(yàn)SPF級(jí)雄性生殖細(xì)胞特異性表達(dá)GFP小鼠8~9周,20只,按照體重隨機(jī)分成2組,分別設(shè)為用藥組和對(duì)照組。采用灌胃方式進(jìn)行染毒,用藥組小鼠按0.1ml/10g的劑量給予25mg/ml EGME溶液,對(duì)照組給予相同劑量的生理鹽水。兩組動(dòng)物染毒后分兩個(gè)階段—用藥11天和用藥34天,從活體器官、離體組織和細(xì)胞水平觀察小鼠睪丸綠色熒光強(qiáng)度變化并進(jìn)行常規(guī)毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的采集。常規(guī)的毒理學(xué)指標(biāo)顯示:用藥組小鼠睪丸重量與對(duì)照組小鼠睪丸重量相比明顯減小;睪丸組織HE染色觀察顯示用藥11天時(shí)小鼠精母細(xì)胞大量減少,用藥34天時(shí)小鼠的精母細(xì)胞和精子細(xì)胞基本消失,同時(shí)睪丸正常結(jié)構(gòu)被破壞。觀察睪丸熒光強(qiáng)度結(jié)果顯示:活體睪丸綠色熒光在用藥34天時(shí)基本消失;用藥11天與用藥34天小鼠離體睪丸的熒光強(qiáng)度均低于對(duì)照組;因GFP主要表達(dá)在睪丸中的精母細(xì)胞和精子細(xì)胞,這在器官水平上就說明了乙二醇單甲醚可能影響了小鼠睪丸細(xì)胞中的精母細(xì)胞和精子細(xì)胞;睪丸組織切片熒光觀察顯示在用藥11天時(shí)小鼠睪丸組織中精母細(xì)胞的綠色熒光基本消失,而在靠近生精小管管腔部位的精子細(xì)胞中仍然可以觀察到綠色熒光,在用藥34天時(shí)小鼠的精母細(xì)胞和精子細(xì)胞中綠色熒光均消失,這說明精母細(xì)胞是EGME的靶細(xì)胞。睪丸綠色熒光觀察結(jié)果與睪丸重量檢測(cè)和病理學(xué)觀察結(jié)果相符。利用Cre-lox P系統(tǒng)成功制備了雄性生殖細(xì)胞特異性表達(dá)GFP小鼠模型,并用EGME給予驗(yàn)證。此模型小鼠可以在器官水平上觀察毒性作用的靶細(xì)胞,能實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)的觀察生殖系統(tǒng)的變化,可減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用量、縮短試驗(yàn)時(shí)間,為開發(fā)雄性生殖毒理學(xué)研究中的動(dòng)物模型和實(shí)驗(yàn)技術(shù)奠定基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R114

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 辛華，，邵紅蓮;制備小鼠雄性生殖細(xì)胞微核標(biāo)本的簡易方法[J];癌變.畸變.突變;1994年06期

2 李彥鋒;雄性生殖細(xì)胞體外分化研究現(xiàn)狀[J];中華男科學(xué);2004年02期

3 盧夏英;楊蓓;徐斯凡;鄒挺;;STRA8表達(dá)作為出生后雄性生殖細(xì)胞特異性標(biāo)志的應(yīng)用研究現(xiàn)狀[J];中華男科學(xué)雜志;2010年02期

4 張波,劉承蕓,孟紫強(qiáng);二氧化硫氣體對(duì)小鼠雄性生殖細(xì)胞的毒性作用研究[J];衛(wèi)生研究;2005年02期

5 孫濤;朱一晨;辛鐘成;;雄性生殖細(xì)胞中的新型RNAs:piRNAs[J];中國男科學(xué)雜志;2008年02期

6 ;小鼠雄性生殖細(xì)胞生后發(fā)育中的程序性死亡[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);1999年03期

7 蔣爾鵬;轉(zhuǎn)化生長因子β超家族在雄性生殖細(xì)胞發(fā)育中的作用[J];中華男科學(xué);2002年06期

8 栗世如,鐘進(jìn)義;葡多酚對(duì)雄性生殖細(xì)胞輻射損傷的影響[J];癌變.畸變.突變;1999年06期

9 王麗;姜宏;;雄性生殖細(xì)胞冷凍保存研究進(jìn)展[J];國際生殖健康/計(jì)劃生育雜志;2013年06期

10 朱玉琢,龐慧民,高久春,邢沈陽,胥耘荊;中草藥遠(yuǎn)志對(duì)實(shí)驗(yàn)性小鼠雄性生殖細(xì)胞遺傳物質(zhì)損傷的保護(hù)作用[J];吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2003年03期

相關(guān)會(huì)議論文 前1條

1 王蘭;;鎘對(duì)長江華溪蟹雄性生殖細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響[A];中國海洋與湖沼學(xué)會(huì)甲殼動(dòng)物學(xué)分會(huì)、中國動(dòng)物學(xué)會(huì)、中國海洋與湖沼學(xué)會(huì)生態(tài)學(xué)分會(huì)2000年學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要集[C];2000年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前2條

1 徐海霞;Hnrnpk及Dnmts在哺乳動(dòng)物雄性生殖細(xì)胞發(fā)育過程中的表達(dá)及功能研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2015年

2 戴立勝;GRTH/DDX25通過調(diào)節(jié)睪丸特異miRNA-469控制雄性生殖細(xì)胞的發(fā)育[D];吉林大學(xué);2011年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前5條

1 郭曉琪;家蠶雄性生殖細(xì)胞對(duì)化學(xué)誘變的修復(fù)作用研究[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

2 王志茹;雄性生殖細(xì)胞特異性表達(dá)GFP小鼠的制備及其在生殖毒性研究中的應(yīng)用[D];吉林大學(xué);2016年

3 潘少輝;小鼠胚胎干細(xì)胞向雄性生殖細(xì)胞誘導(dǎo)分化的研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2010年

4 張姍姍;miR-34c在小鼠胚胎干細(xì)胞向雄性生殖細(xì)胞分化過程中的作用[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2011年

5 王芳;奶山羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及向雄性生殖細(xì)胞誘導(dǎo)分化[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2011年

本文編號(hào)：1591484