本文關(guān)鍵詞： 3-氯-1 2-丙二醇 1 3-二氯-2-丙醇 孕酮 活性氧 線粒體膜電位 環(huán)腺苷酸 類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白　出處：《暨南大學(xué)》2013年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的： 利用大鼠睪丸間質(zhì)瘤細(xì)胞R2C、小鼠受精卵細(xì)胞和早期胚胎為實(shí)驗(yàn)對象，初步探索氯丙醇（chloropropanol，CP）兩種主要形式，即3-氯-1,2-丙二醇（3-monochloropropane-1,2-diol，3-MCPD）和1,3-二氯-2-丙醇（1,3-dichloro-2-propanol，1,3-DCP）影響生殖的毒性機(jī)制探索。 方法： MTT法檢測CP對R2C細(xì)胞的生長影響和篩選CP實(shí)驗(yàn)濃度；原子力顯微鏡（atomic force microscopy，AFM）和單細(xì)胞電泳法（single cell gel electrophoresisassay，SCGE）觀察細(xì)胞形態(tài)和DNA損傷作用；放射免疫法（radioimmunoassay，RIA）檢測細(xì)胞孕酮的合成和分泌狀況；QRT-PCR法檢測孕酮合成通路中關(guān)鍵基因StAR、P4C_(50)scc和3β-HSD mRNA水平；Western blotting法檢測StAR和3β-HSD蛋白水平；流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）檢測細(xì)胞線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）；化學(xué)發(fā)光法（chemiluminescence，CL）檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactie oxygen species，ROS）和環(huán)腺苷酸（cyclic adenosinemonophosphate，cAMP）的水平。體外受精檢測小鼠卵母細(xì)胞碎裂率、受精率和受精卵早期胚胎發(fā)育狀況。 結(jié)果： 3-MCPD和1,3-DCP均可抑制R2C細(xì)胞生長。3-MCPD的IC_(25)、ICC_(50)和IC_(75)分別為1.027、1.802和3.160mM；1,3-DCP的IC_(25)、ICC_(50)和IC_(75)分別為1.161、1.897和3.100mM。AFM結(jié)果，3-MCPD或1,3-DCP刺激R2C細(xì)胞24h，隨著IC_(25)、ICC_(50)到IC_(75)刺激劑量的增加，細(xì)胞體積逐漸變小，外形由多邊趨向橢圓，細(xì)胞膜的變化用平均粗糙度（Ra）、均方根粗糙度（Rq）和平均高度（Rpm）來量化分析。3-MCPD各刺激組（IC_(25)、ICC_(50)和IC_(75)）和對照組的Ra值分別為36.10±4.46nm、40.80±10.04nm、82.92±12.73nm和14.70±2.44nm；Rq值分別為45.72±4.838nm、C_(50).70±12.70nm、101.80±15.04nm和18.48±3.075nm；Rpm值分別為33.00±11.19nm、36.42±11.21nm、92.36±17.18nm和18.88±3.867nm。1,3-DCP各刺激組和對照組的Ra值分別為38.10±5.90nm、48.80±14.29nm、84.92±15.47nm和14.70±2.44nm；Rq值分別為51.98±6.35nm、60.08±13.25nm、108.5±7.47nm和18.48±3.075nm；Rpm值分別為35.00±11.52nm、46.42±13.72nm、100.4±18.54nm和18.88±3.867nm。以上各實(shí)驗(yàn)組與對照組之間進(jìn)行兩兩比較，均有顯著性差異（p＜0.05）。這些結(jié)果提示，3-MCPD和1,3-DCP對R2C細(xì)胞均有損傷作用。SCGE結(jié)果，3-MCPD或1,3-DCP刺激R2C細(xì)胞4h，用尾部DNA含量、尾長和Olive尾距來量化刺激組DNA的損傷狀況。3-MCPD各刺激組和對照組尾部DNA含量分別為10.243±1.073%、11.427±1.865%、18.984±1.640%和4.288±0.660%；尾長分別為17.429±1.913μm、19.333±1.647μm、29.167±2.332μm和12.286±0.808μm；Olive尾距分別為3.247±0.471μm、4.844±0.807μm、8.965±0.800μm和1.759±0.144μm。1,3-DCP各刺激組和對照組尾部DNA含量分別為23.80±2.48%、34.33±3.18%、38.03±3.63%和4.29±0.66%；尾長分別為58.67±6.38μm、79.67±5.86μm、84.86±6.07μm和12.29±0.81μm；Olive尾距分別為7.80±1.13μm、18.C_(50)±1.22μm、21.05±2.74μm和1.76±0.14μm。以上各實(shí)驗(yàn)組與對照組之間進(jìn)行比較，均有顯著性差異（p＜0.05）。3-MCPD和1,3-DCP對細(xì)胞DNA均有損傷作用。RIA結(jié)果，3-MCPD或1,3-DCP刺激R2C細(xì)胞4h或24h，隨著濃度的增加或時(shí)間的延長，具有抑制孕酮合成能力。3-MCPD刺激細(xì)胞4h，各刺激組與對照組相比，孕酮合成量沒有顯著性差異（p＞0.05）；3-MCPD繼續(xù)作用細(xì)胞到24h，各刺激組和對照組的孕酮合成量分別為126.83±6.53ng、111.56±3.04ng、54.28±4.67ng和140.24±6.89ng。各刺激組與對照組相比有顯著性差異（p＜0.05）。1,3-DCP刺激細(xì)胞4h，刺激組和對照組孕酮合成量分別為11.37±0.42ng、11.43±0.37ng、10.98±0.37ng和12.90±0.58ng，各刺激組與對照組相比均有顯著性差異（p＜0.05）；1,3-DCP繼續(xù)作用細(xì)胞到24h，各刺激組和對照組孕酮合成量分別為131.41±2.37ng、115.32±1.87ng、23.85±3.63ng和138.92±3.59ng。ICC_(50)和IC_(75)組分別與對照組進(jìn)行比較，均有顯著性差異（p＜0.05）。QRT-PCR結(jié)果，3-MCPD或1,3-DCP刺激R2C細(xì)胞4h或24h，隨著濃度的增加或時(shí)間的延長，具有抑制StAR、P4C_(50)scc和3β-HSD mRNA表達(dá)的能力。3-MCPD刺激細(xì)胞4h，StAR和P4C_(50)scc mRNA表達(dá)量在各組間無顯著性差異（p＞0.05）；3β-HSD mRNA表達(dá)量在IC_(75)組比對照組下降46.8±6.90%，有顯著性差異（p＜0.05），IC_(25)和ICC_(50)組分別與對照組相比，無顯著性差異（p＞0.05）。3-MCPD刺激細(xì)胞24h，StAR mRNA表達(dá)量在ICC_(50)和IC_(75)組分別比對照組下降25.1±3.0%和51.7±3.0%；P4C_(50)scc mRNA表達(dá)量在IC_(25)、ICC_(50)和IC_(75)組分別比對照組下降32.6±2.3%、32.5±2.7%和31.9±1.9%；3β-HSD mRNA表達(dá)量在IC_(75)組比對照組下降21.8±4.4%。上述比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）。1,3-DCP刺激細(xì)胞4h，StAR mRNA表達(dá)量組間無顯著性差異（p＞0.05）；P4C_(50)scc mRNA表達(dá)量在IC_(75)組比對照組降低20.8±3.5%；3β-HSD mRNA表達(dá)量在IC_(25)、ICC_(50)和IC_(75)組分別比對照組降低39.5±5.5%、67.1±3.6%和70.4±1.7%。上述比較有顯著性差異（p＜0.05）。1,3-DCP刺激細(xì)胞24h，StAR mRNA表達(dá)量在IC_(25)、ICC_(50)和IC_(75)組分別比對照組下降44.6±2.9%、45.6±2.3%和C_(50).3±4.6%；P4C_(50)scc mRNA表達(dá)量在ICC_(50)和IC_(75)組分別比對照組降低24.3±3.8%和45.5±4.4%；3β-HSD mRNA表達(dá)量在ICC_(50)和IC_(75)組分別比對照組降低27.6±2.6%和28.0±5.1%。上述比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）。Western blotting檢測結(jié)果，3-MCPD或1,3-DCP刺激R2C細(xì)胞4h或24h，隨著濃度的增加或時(shí)間的延長，，具有抑制StAR和3β-HSD蛋白表達(dá)的能力。3-MCPD刺激細(xì)胞4h，3β-HSD蛋白表達(dá)量在IC_(75)組比對照組下降60.5±5.1%，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）。3-MCPD刺激細(xì)胞24h， StAR蛋白表達(dá)量在IC_(75)組比對照組下降44.0±4.1%；3β-HSD蛋白表達(dá)量在ICC_(50)和IC_(75)組分別比對照組下降38.2±6.3%和63.0±7.1%。上述比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）。1,3-DCP刺激細(xì)胞4h，StAR和3β-HSD蛋白表達(dá)量在IC_(75)組與對照組相比分別下降25.8±5.8%和C_(50).2±12.0%，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）。1,3-DCP刺激細(xì)胞24h，StAR蛋白表達(dá)量在IC_(75)組比對照組下降28.6±2.9%；3β-HSD蛋白表達(dá)量在IC_(25)、ICC_(50)和IC_(75)組分別比對照組下降42.0±2.5%、34.6±5.2%和43.3±5.1%。上述比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）。FCM檢測結(jié)果，3-MCPD刺激R2C細(xì)胞4h或24h，各刺激組MMP比對照組分別下降35.0±4.5%、35.5±3.9%、33.1±5.5%或23.7±5.9%、49.0±7.8%、53.9±9.4%，所述比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）。1,3-DCP刺激R2C細(xì)胞4h，ICC_(50)和IC_(75)組比對照組分別下降24.3%和30.7%；繼續(xù)刺激細(xì)胞到24h，IC_(75)組比對照組下降53.7%。所述比較有顯著性差異（p＜0.05）。CL結(jié)果，3-MCPD刺激4h或12h各刺激組ROS水平比對照組分別升高60.9±17.1%、58.7±28.8%、93.5±20.1%或C_(50).5±23.9%、62.9±15.2%、71.4±20.3%，所述比較有顯著性差異（p＜0.05）；同樣條件，3-MCPD刺激細(xì)胞1h或24h，所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果與對照組相比無顯著性差異（p＞0.05）。1,3-DCP刺激細(xì)胞4h或12h，各刺激組ROS比對照組分別升高110.9±19.1%、138.7±20.8%、113.5±25.1%或C_(50).5±13.98%、92.9±17.2%、111.4±24.3%，除外IC_(25)12h組，其他所述比較有顯著性差異（p＜0.05）；同樣條件，1,3-DCP刺激細(xì)胞1h或24h，所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果與對照組相比亦無顯著性差異（p＞0.05）。cAMP檢測結(jié)果，3-MCPD刺激R2C細(xì)胞4h，ICC_(50)和IC_(75)組cAMP水平比對照組分別降低30.0±7.2%和33.6±12.2%；1,3-DCP刺激R2C細(xì)胞4h，IC_(75)組cAMP水平比對照組降低34.4±11.9%。上述比較有顯著性差異（p＜0.05）。體外受精實(shí)驗(yàn)結(jié)果，3-MCPD刺激小鼠卵母細(xì)胞，各刺激組和對照組碎裂率分別為10.14±3.82%、37.96±8.63%、46.15±6.94%和0%，各刺激組與對照組相比均有顯著性差異（p＜0.05）。各刺激組和對照組受精率分別為77.00±12.79%、17.86±10.C_(50)%、13.24±6.38%和90.52±15.41%，ICC_(50)和IC_(75)組與對照組相比有顯著性差異（p＜0.05）。早期胚胎發(fā)育結(jié)果，3-MCPD刺激小鼠受精卵，各刺激組和對照組2-細(xì)胞形成率分別為72.96±12.27%、60.76±12.68%、61.27±14.68和90.01±8.52%；4-細(xì)胞形成率分別為6.73±3.95%、5.63±3.74%、0.10±0.10%和24.41±8.33%；8-細(xì)胞形成率分別為0%、0%、0%和7.04±3.10%。各刺激組與對照組相比均有顯著性差異（p＜0.05）。 結(jié)論： 3-MCPD和1,3-DCP均有抑制R2C細(xì)胞生長作用，隨著刺激濃度從IC_(25)到IC_(75)，細(xì)胞形態(tài)改變、細(xì)胞膜損傷和DNA損傷更明顯；3-MCPD和1,3-DCP均能抑制孕酮合成。3-MCPD和1,3-DCP引起R2C細(xì)胞形態(tài)和功能改變的分子機(jī)制可能涉及StAR、P4C_(50)scc和3β-HSD基因表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞MMP下降，細(xì)胞ROS上升和cAMP下降。3-MCPD抑制小鼠卵母細(xì)胞體外受精和早期胚胎發(fā)育。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R114

【參考文獻(xiàn)】

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1 李寧,劉澤欽,賈旭東,崔文明,王偉,張馨,韓馳,陳君石,王茂起;氯丙醇對大鼠的毒性研究[J];衛(wèi)生研究;2003年04期

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本文編號：1555826