發(fā)布時間：2018-02-24 06:00

  本文關鍵詞： NSC 分化 DNA甲基化 葉酸　出處：《天津醫(yī)科大學》2013年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的 本實驗主要研究葉酸(Folic acid)對體外培養(yǎng)神經干細胞(neural stem cells, NSCs)分化方向的影響,探討葉酸基于DNA甲基化途徑調控NSCs分化的機制。為NSCs移植和定向分化提供科學依據。 方法 采用無血清細胞培養(yǎng)法,培養(yǎng)新生大鼠海馬NSCs,用SOX2和BrdU免疫熒光雙標鑒定,并將NSCs分為5組：①對照組(folic acid-free differentiation medium, Control),②低葉酸組(low folic acid,8μg/mL, FA-L),③高葉酸組(high folic acid,32μg/mL, FA-H),④低葉酸加甲基阻斷劑組(8μg/mL folic acid and150nmol/mL zebularine, FAL-Z),⑤高葉酸加甲基阻斷劑組(32μg/mL folic acid and150nmol/mL zebularine, FAH-Z)。在分化第1天加甲基阻斷劑作用,48h后換正常培養(yǎng)液,收集分化第6天細胞。分別采用免疫熒光(Immunofluorescent, IF)和免疫印跡(Western Blot)檢測神經元的特異性標志物β-tubulin Ⅲ和星形膠質細胞的特異性標志物GFAP的表達；采用DNA甲基化定量試劑盒檢測不同葉酸濃度下細胞總甲基化水平；甲基轉移酶活性檢測試劑盒檢測DNMTs總活性,Western Blot檢測DNA甲基轉移酶(DNA methyltransferases, DNMTs)的蛋白表達；用高效液相法(HPLC)檢測細胞內S-腺苷甲硫氨酸(s-adenosylmethionine, SAM)、S-腺苷同型半胱氨酸(s-adenosylhomocysteine, SAH)的水平；Western Blot檢測JAK-STAT通路中信號轉導和轉錄激活因子STAT(Signal transducers and activators of transcription, STAT)中STAT1和STAT3的磷酸化水平；采用MeDIP-qPCR(甲基化DNA免疫共沉淀-實時定量PCR)檢測GFAP基因啟動子的甲基化水平。 結果 采用無血清培養(yǎng)法體外細胞培養(yǎng)6d后,細胞聚集成球形團塊,邊緣發(fā)亮,折光性強,呈懸浮狀態(tài),經SOX2和BrdU免疫熒光雙標記法鑒定呈雙陽性。體外誘導分化后,免疫熒光標記和Western Blot檢測結果顯示：與對照組相比,低葉酸組和高葉酸組的β-tubulin Ⅲ陽性表達率均增加,GFAP的陽性表達率均減少,低葉酸加甲基阻斷劑組和高葉酸加甲基阻斷劑組β-tubulin Ⅲ陽性表達率均減少,GFAP的陽性表達率均增加,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)；低葉酸加甲基阻斷劑組與低葉酸組相比,低葉酸加甲基阻斷劑組β-tubulin Ⅲ陽性表達率下降,GFAP陽性表達率增加,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)；高葉酸加甲基阻斷劑組與高葉酸組相比,高葉酸加甲基阻斷劑組P-tubulin III陽性表達率下降,GFAP陽性表達率增加,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)o DNA,總甲基化水平檢測結果顯示：與對照組相比,低葉酸組和高葉酸組細胞總甲基化水平均增加,且高葉酸組總甲基化水平高于低葉酸組,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。DNMTs總活性檢測結果顯示：與對照組相比,低葉酸組和高葉酸組的DNMTs總活性均增強,低葉酸加甲基阻斷劑組和高葉酸加甲基阻斷劑組的DNMTs總活性均降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)；低葉酸加甲基阻斷劑組與低葉酸組相比,低葉酸加甲基阻斷劑組DNMTs總活性顯著降低,高葉酸加甲基阻斷劑組與高葉酸組相比,高葉酸加甲基阻斷劑組DNMTs總活性下降,且高葉酸加甲基阻斷劑組DNMTs總活性高于低葉酸加甲基阻斷劑組,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。Western Blot檢測DNMTs的蛋白表達,結果顯示：與對照組相比,DNMT1和DNMT3a的蛋白表達在低葉酸組和高葉酸組均增加,DNMT3b的蛋白表達僅在高葉酸組增加,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。HPLC檢測結果顯示：與對照組相比,低葉酸組和高葉酸組的SAM水平升高,SAH的水平降低,SAM/SAH的比值增加,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。Western Blot檢測p-STAT1, p-STAT3表達,結果顯示：與對照組相比,高葉酸組p-STAT3的表達下降,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05); p-STAT1在各組中的表達無顯著改變,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。MeDIP-qPCR檢測結果顯示：與對照組相比,低葉酸組和高葉酸組GFAP基因啟動子甲基化水平升高,且高葉酸組高于低葉酸組,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 結論 本實驗結果顯示,葉酸減少體外神經干細胞向神經膠質方向分化,進而增加向神經元方向分化比例。其可能的機制是：葉酸通過增加DNMT1, DNMT3a/3b蛋白的表達提高DNMTs總活性水平,通過改變甲基化途徑中關鍵代謝物SAM和SAH濃度,促進甲基化反應的發(fā)生,提高星形膠質細胞GFAP基因啟動子的甲基化水平,同時降低p-STAT3的表達,協同抑制NSCs向星形膠質細胞的分化,從而提高神經元的分化比例。
[Abstract]:objective
The aim of this study is to investigate the effect of folic acid (Folic acid) on the differentiation direction of neural stem cells (NSCs) in vitro, and to explore the mechanism of folic acid regulating NSCs differentiation based on DNA methylation pathway. It will provide a scientific basis for NSCs transplantation and directional differentiation.
Method
Cell culture in serum-free medium, cultured NSCs neonatal rat hippocampus, using SOX2 and BrdU immunofluorescence identification, NSCs was divided into 5 groups: control group (folic acid-free, differentiation medium, Control), low folic acid group (low folic acid, 8 g/mL, FA-L), the high folic acid group (high folic acid, 32 g/mL, FA-H), the low folic acid and methyl blocker group (8 g/mL folic acid and150nmol/mL zebularine, FAL-Z), the high folic acid and methyl blocker group (32 g/mL folic acid and150nmol/mL zebularine, FAH-Z). The antagonist role in differentiation of first days after 48h for normal methyl. The culture medium, collected sixth days. Cell differentiation were detected by immunofluorescence (Immunofluorescent, IF) and immunoblotting (Western Blot) to detect neuron specific markers of beta -tubulin III and astrocyte specific marker GFAP expression by DNA methylation set; The amount of kit for detection of cell total methylation in different concentration of folic acid level; methyltransferase activity detection kit to detect DNMTs activity, Western Blot detection of DNA methyltransferase (DNA methyltransferases DNMTs) protein expression; by high performance liquid chromatography (HPLC) detection of S- intracellular S-adenosylmethionine (S-adenosylmethionine, SAM). S- adenosylhomocysteine (S-adenosylhomocysteine, SAH) level; Western Blot JAK-STAT signal pathway transduction and transcription factor STAT (Signal transducers and activators of transcription, STAT) STAT1 and STAT3 phosphorylation; using MeDIP-qPCR (methylated DNA immunoprecipitation - real-time quantitative methylation of GFAP PCR) gene promoter.
Result
Using the serum-free culture method of cell culture in vitro after 6D cell aggregation of spherical agglomerates, edge illuminated, strong refraction, a suspended state, by SOX2 BrdU and immunofluorescence method to identify a double positive. In vitro differentiation, immunofluorescence and Western Blot detection results showed that: compared with the control group, low folic acid group and high folic acid group III beta -tubulin positive expression rate was increased, the positive rate of GFAP were reduced, low folic acid and methyl blocker group and high folic acid and methyl group beta blocker of -tubulin positive expression rate decreased, GFAP positive expression rate was increased, the differences were statistically significant (P0.05); low folic acid and methyl blockers compared with low folate group, low folic acid and methyl beta blocker group III -tubulin positive expression rate decreased, the positive expression rate of GFAP increased, the differences were statistically significant (P0.05); high leaf acid and methyl block Compared with the high dose group high folic acid group, folic acid and methyl blockers P-tubulin III positive expression rate decreased, the positive expression rate of GFAP increased, the differences were statistically significant (P0.05 o DNA), the total methylation level. The results showed that: compared with the control group, low folate group and high folate group cell total methylation average increased, and high folic acid group the total methylation level lower than that of the folic acid group, there were statistically significant differences in the total activity of.DNMTs (P0.05). The results showed that: compared with the control group, low folic acid group and the total activity of DNMTs is high in folic acid group were enhanced, low folic acid and methyl blocker group and high folic acid and methyl blocker group the total activity of DNMTs decreased, the differences were statistically significant (P0.05); low folic acid and methyl blockers compared with low folate group, low folic acid and methyl blocker group total DNMTs activity decreased significantly, high folic acid and methyl blockers and high leaf Acid group, high folic acid and methyl blocking agent group decreased DNMTs activity, and high folic acid and methyl blocker group the total activity of DNMTs was higher than that of low folic acid and methyl blocker group, there were statistically significant differences in the expression of.Western Blot (P0.05), the detection of DNMTs protein results showed that: compared with the control group, the expression of DNMT1 and DNMT3a the protein increased in low folate group and high folic acid group, the expression of DNMT3b protein was increased in high folic acid group, the differences were statistically significant (P0.05.HPLC). The results showed that: compared with the control group, low folate group and high folate group SAM level increased, the lower the level of SAH, increase the SAM/SAH ratio. There were statistically significant differences (P0.05).Western Blot detection of p-STAT1, p-STAT3 expression, results showed that: compared with the control group, decreased expression of high folic acid group p-STAT3, the difference was statistically significant (P0.05); the expression of p-STAT1 in each group no There was no significant difference in the significant change (P0.05)..MeDIP-qPCR test results showed that compared with the control group, the methylation level of GFAP gene promoter in folate group and folate group increased, and the folate group was higher than that in the low folate group, the difference was statistically significant (P0.05).
conclusion
The experimental results show that the reduction of folic acid in vitro of neural stem cells to glial differentiation, and differentiate into neurons increased. The possible mechanism is that folic acid by increasing the DNMT1 expression of DNMT3a/3b protein increased the total activity of DNMTs level, by changing the methylation pathway in key metabolites SAM and SAH concentration, promote the occurrence of the reaction of methyl the level of methylation increased astrocytic GFAP gene promoter, and reducing the expression of p-STAT3 differentiation, synergistic inhibition of NSCs to astrocytes, thereby enhancing neuronal differentiation ratio.

【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R151.2

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