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雜色曲霉素對體外培養(yǎng)人支氣管上皮細胞(BEAS-2B)細胞周期影響的研究

發(fā)布時間:2018-02-10 11:17

  本文關鍵詞: 雜色曲霉素 人支氣管上皮細胞 DNA 雙鏈斷裂 細胞周期阻滯 細胞周期調(diào)控蛋白 出處:《河北醫(yī)科大學》2013年碩士論文 論文類型:學位論文


【摘要】:目的:雜色曲霉素(Sterigmatocystin,ST)是曲霉菌屬、青霉菌屬和離蠕孢霉屬產(chǎn)生的一種代謝產(chǎn)物。其污染非常廣泛,普遍存在于谷物、玉米、豆類、香料和動物飼料中。除糧食作物和飼料外,ST在室內(nèi)環(huán)境中的污染也比較常見。鑒于ST的致畸性、致突變性和致癌性,國際癌癥研究中心已將其確認為“可能的人類致癌物”。動物實驗發(fā)現(xiàn),ST可以引起小鼠發(fā)生肺腺癌;體外實驗發(fā)現(xiàn),ST可以誘發(fā)人胚肺細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。提示ST具有致肺癌性。由于對應用人胚的顧忌,實驗不能夠繼續(xù)進行。因此,對ST致肺癌機制的研究還遠遠不夠。 真核細胞通過復雜的細胞周期調(diào)控和凋亡系統(tǒng)來控制細胞的分裂增殖與死亡,從而維持機體的正常代謝和增殖。細胞周期調(diào)控失常時細胞會發(fā)生異常增殖,從而導致各種疾病的發(fā)生,甚至腫瘤的形成。當細胞發(fā)生DNA損傷后,細胞周期會停滯在某一時相為修復受損的DNA提供充足的時間,避免將該損傷遺傳至子代細胞。體內(nèi)和體外實驗發(fā)現(xiàn),很多真菌毒素(如T-2毒素、桔霉素、赭曲霉毒素等)對細胞的毒性作用均表現(xiàn)為可以誘導細胞發(fā)生周期阻滯。此外,我們近期研究發(fā)現(xiàn),ST處理能誘導人胃粘膜上皮細胞(GES-1)和人食管粘膜上皮細胞(Het-1A)發(fā)生G2期阻滯。研究表明ST可以誘導體外培養(yǎng)人肺癌細胞(A549)發(fā)生DNA損傷,但ST對正常人肺上皮細胞DNA損傷、細胞周期分布及其可能機制的研究尚未見報道。 鑒于此,為探討ST與人類肺癌發(fā)生的可能機制之間的關系,本研究選取人永生化支氣管上皮細胞(BEAS-2B)作為研究對象,觀察不同濃度ST處理對BEAS-2B細胞DNA損傷、周期分布的影響并從分子角度初步分析其可能的機制,以揭示ST對正常人肺上皮細胞的毒性作用。 方法:1細胞培養(yǎng) 正常人永生化支氣管上皮細胞(BEAS-2B)培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素的DMEM/F12混合培養(yǎng)基中,37℃、5%CO2培養(yǎng),細胞貼壁生長。2噻唑藍(MTT)比色法2.1單細胞懸液制備及細胞計數(shù) 取對數(shù)生長期的BEAS-2B細胞,用0.25%胰酶+0.02%EDTA常規(guī)消化,吹打混勻后取10μl滴于血細胞計數(shù)板上在顯微鏡下計數(shù)。計算公式為:細胞數(shù)(個細胞/ml)=(4個大格細胞總數(shù)/4)×104×稀釋倍數(shù)。2.2MTT比色法測定細胞存活率 用新鮮培養(yǎng)基調(diào)整BEAS-2B單細胞懸液濃度,使其終濃度為1×104個細胞/ml,接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi),每孔200μl。24h后吸掉上清液,加入低血清(1%)的DMEM/F12混合培養(yǎng)基,同步化處理24h后,更換新鮮的10%DMEM/F12混合培養(yǎng)基,同時給予ST,使其終濃度分別為0.06μM、0.15μM、0.3μM、0.6μM、1.5μM、3μM、6μM、12μM、24μM、48μM、96μM、192μM、240μM,溶劑對照組加入DMSO,每個濃度設6孔,繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)后24h每孔加入5mg/ml MTT20μl,繼續(xù)培養(yǎng)4h,吸棄孔內(nèi)上清,每孔加入150μl DMSO,充分振蕩混勻,用多功能酶標儀測定各個孔在490nm處的OD值,并通過下列公式計算細胞存活率:細胞存活率(%)=(實驗組OD490值/對照組OD490值)×100%。3實驗分組與處理 根據(jù)MTT結(jié)果篩選出ST的最佳處理劑量,分別為6μM、12μM和24μM。取對數(shù)生長期的細胞,將其隨機分為溶劑對照組和實驗組。實驗組給予ST處理,其終濃度分別為6、12和24μM,溶劑對照組給予等體積的DMSO處理,繼續(xù)培養(yǎng)24h后常規(guī)消化,收集細胞,進行后續(xù)實驗,檢測相關指標。4流式細胞術(shù)(FCM)檢測細胞凋亡與細胞周期分布 ST處理24h后,分別收集溶劑對照組和各實驗組細胞,PBS洗滌2次,1000rpm離心5min,收集細胞,70%冰乙醇固定后檢測細胞周期的分布情況。5蛋白免疫印跡法(Western blot) 不同濃度ST作用于BEAS-2B細胞24h后,分別提取細胞總蛋白,經(jīng)BCA蛋白濃度測定試劑盒定量后,采用蛋白免疫印跡技術(shù),檢測ST處理后正常人支氣管上皮細胞BEAS-2B中磷酸化型H2AX以及各細胞周期調(diào)控蛋白在蛋白水平的表達情況。6統(tǒng)計 所有實驗至少重復3次,采用SPSS13.0軟件進行單因素方差分析(analysis of variance, ANOVA),量效依賴關系采用雙變量相關與回歸分析,所有數(shù)據(jù)均用x±s表示,檢驗以P0.05為顯著性差異標準。 結(jié)果:1ST可以抑制BEAS-2B細胞增殖 本實驗應用MTT評價不同濃度ST對BEAS-2B細胞增殖的影響。結(jié)果表明,ST對BEAS-2B細胞的生長有明顯的抑制作用,經(jīng)ST處理24h后12、24、48、96、192、240μM ST處理組BEAS-2B細胞存活率均明顯低于溶劑對照組,與濃度呈負相關關系(r=-0.91P0.05)。2ST可以誘導體外培養(yǎng)BEAS-2B細胞DNA雙鏈斷裂 γ-H2AX的蛋白分子量為14KD,經(jīng)過SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜后,溶劑對照組和各實驗組均在14KD的位置出現(xiàn)了陽性條帶。以β-actin(42KD)為內(nèi)參照,經(jīng)定量分析后,結(jié)果顯示,6、12和24μM ST處理24h后,γ-H2AX的表達水平明顯高于溶劑對照組并且隨著ST濃度增加而升高。(r=0.914P0.05)。 以上結(jié)果提示,ST處理能夠誘導BEAS-2B細胞DNA雙鏈斷裂。3ST可誘導體外培養(yǎng)BEAS-2B細胞發(fā)生細胞周期阻滯 FCM結(jié)果顯示,6μM和12μM ST處理24h后,G0/G1期細胞比例減少,G2/M期細胞比例增多(P0.05)。24μM ST處理24h后,G0/G1期細胞比例下降,而S期和G2/M期細胞比例均增加(P0.05)。 以上結(jié)果提示,不同濃度的ST處理可以誘導BEAS-2B細胞發(fā)生不同的細胞周期阻滯。低濃度6μM和12μM ST處理能誘導BEAS-2B細胞發(fā)生G2/M期阻滯,而高濃度24μM ST處理則誘導其發(fā)生S期和G2/M期阻滯。4ST對細胞周期關鍵調(diào)控因子的影響4.1ST對G1期關鍵調(diào)控蛋白的影響4.1.1ST可以上調(diào)CyclinD1的蛋白表達水平 CyclinD1蛋白分子量為36KD,經(jīng)過SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜后,溶劑對照組和各ST處理組均在36KD的位置出現(xiàn)了陽性條帶。以β-actin(42KD)為內(nèi)參照,經(jīng)定量分析后,結(jié)果表明,不同濃度ST處理后CyclinD1的表達水平與溶劑對照組相比明顯升高,與濃度呈正相關關系,差異具有顯著性(r=0.992P0.05)。4.1.2ST對CDK4蛋白表達水平無明顯影響 CDK4的蛋白分子量是34KD,經(jīng)過SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜后,溶劑對照組和各實驗組均在34KD的位置出現(xiàn)了陽性條帶。以β-actin(42KD)作為內(nèi)參照,經(jīng)定量分析后,結(jié)果顯示,各實驗組CDK4的表達水平?jīng)]有明顯變化,與溶劑對照組相比差異無顯著性(P0.05)。4.1.3ST可以上調(diào)CyclinE1的蛋白表達水平 CyclinE1的蛋白分子量是47KD,經(jīng)過SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜后,溶劑對照組和各實驗組均在47KD的位置出現(xiàn)了陽性條帶。以β-actin(42KD)為內(nèi)參照,經(jīng)定量分析后,結(jié)果顯示,與溶劑對照組相比,不同濃度ST處理后CyclinE1的表達水平明顯升高(P0.05)。4.1.4ST可以上調(diào)CDK2的蛋白表達水平 CDK2的蛋白分子量是33KD,經(jīng)過SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜后,溶劑對照組和各ST處理組均在33KD的位置出現(xiàn)了陽性條帶。以β-actin(42KD)為內(nèi)參照,經(jīng)定量分析后,結(jié)果表明,不同濃度ST處理24h后,CDK2的表達水平明顯高于溶劑對照組(P0.05)。 綜合以上結(jié)果表明,ST處理能上調(diào)BEAS-2B細胞G1期調(diào)控蛋白的表達水平。4.2ST對S期和G2/M期關鍵調(diào)控蛋白的影響4.2.1ST可以下調(diào)CyclinA的蛋白表達水平 CyclinA的蛋白分子量是52KD,經(jīng)過SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜后,溶劑對照組和各實驗組均在52KD的位置出現(xiàn)了陽性條帶。以β-actin(42KD)為內(nèi)參照,經(jīng)定量分析后,結(jié)果顯示,除6μM處理組外,12μM和24μM ST處理組BEAS-2B細胞中CyclinA的表達水平較溶劑對照組相比明顯下降,與濃度呈負相關關系(r=-0.929P0.05)。與12μM處理組相比,24μM ST處理后CyclinA的表達水平降低更明顯(P0.05)。4.2.2ST可以下調(diào)CDK1的蛋白表達水平 CDK1的蛋白分子量為34KD,經(jīng)過SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜后,溶劑對照組和各ST處理組均在34KD的位置出現(xiàn)了陽性條帶。以β-actin(42KD)為內(nèi)參照,經(jīng)定量分析后,結(jié)果表明,與溶劑對照組相比,各ST處理組CDK1的表達水平隨濃度增高而降低(r=-0.941P0.05)。4.2.3ST可以上調(diào)CDK1的磷酸化水平 磷酸化型CDK1的蛋白分子量也是34KD,經(jīng)過SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜后,溶劑對照組和各實驗組均在34KD的位置出現(xiàn)了陽性條帶。以β-actin(42KD)為內(nèi)參照,經(jīng)定量分析后,結(jié)果顯示,6μM、12μM和24μM ST處理24h后,CDK1的磷酸化水平明顯升高,與濃度呈正相關關系(r=1P0.05)。4.2.4ST可以上調(diào)CyclinB1的蛋白表達水平 CyclinB1的蛋白分子量是48KD,經(jīng)過SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜后,溶劑對照組和各實驗組均在48KD的位置出現(xiàn)了陽性條帶。以β-actin(42KD)為內(nèi)參照,經(jīng)定量分析后,結(jié)果表明,與溶劑對照組相比,給予不同濃度ST作用24h后,CyclinB1的表達水平顯著升高(P0.05)。 綜合以上結(jié)果提示ST處理可以誘導BEAS-2B細胞S期和G2/M期細胞周期調(diào)控因子發(fā)生不同的變化。 結(jié)論:1ST可以誘導BEAS-2B細胞發(fā)生DNA雙鏈斷裂。2低濃度(6μM和12μM)ST處理能誘導BEAS-2B細胞發(fā)生G2/M期 阻滯,而高濃度(24μM)ST處理則誘導其發(fā)生S期和G2/M期阻滯。3不同濃度ST處理均可上調(diào)G1期調(diào)控蛋白(CyclinD1,CyclinE1和 CDK2)的表達,從而促進細胞由G1期進入S期。412和24μM ST處理可以下調(diào)CyclinA的表達,提示細胞通過S期的過 程可能會延遲,最終發(fā)生S期阻滯。5不同濃度ST處理可以下調(diào)CDK1的表達,,而上調(diào)CyclinB1的表達和 CDK1的磷酸化水平。這可能與ST誘導細胞發(fā)生G2/M期阻滯有關。
[Abstract]:......
【學位授予單位】:河北醫(yī)科大學
【學位級別】:碩士
【學位授予年份】:2013
【分類號】:R114

【參考文獻】

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1 高燕,林莉萍,丁健;細胞周期調(diào)控的研究進展[J];生命科學;2005年04期

2 葉星星;蔡志毅;劉池波;;細胞周期蛋白G1、G2與惡性腫瘤的研究進展[J];溫州醫(yī)學院學報;2011年03期

3 邢凌霄;張祥宏;申海濤;李月紅;劉靜;邢欣;周丙娟;嚴霞;王俊靈;;雜色曲霉素對新生乳鼠致癌作用的實驗研究[J];中華病理學雜志;2007年04期

4 黃向華,張祥宏,李月紅,王俊靈,嚴霞,邢凌霄,王鳳榮;雜色曲霉素和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇對小鼠致癌作用的研究[J];中華腫瘤雜志;2004年12期



本文編號:1500394

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