本文關鍵詞： 雜色曲霉素 人支氣管上皮細胞 DNA 雙鏈斷裂 細胞周期阻滯 細胞周期調(diào)控蛋白　出處：《河北醫(yī)科大學》2013年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的：雜色曲霉素(Sterigmatocystin，ST)是曲霉菌屬、青霉菌屬和離蠕孢霉屬產(chǎn)生的一種代謝產(chǎn)物。其污染非常廣泛，普遍存在于谷物、玉米、豆類、香料和動物飼料中。除糧食作物和飼料外，ST在室內(nèi)環(huán)境中的污染也比較常見。鑒于ST的致畸性、致突變性和致癌性，國際癌癥研究中心已將其確認為“可能的人類致癌物”。動物實驗發(fā)現(xiàn)，ST可以引起小鼠發(fā)生肺腺癌；體外實驗發(fā)現(xiàn)，ST可以誘發(fā)人胚肺細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。提示ST具有致肺癌性。由于對應用人胚的顧忌，實驗不能夠繼續(xù)進行。因此，對ST致肺癌機制的研究還遠遠不夠。 真核細胞通過復雜的細胞周期調(diào)控和凋亡系統(tǒng)來控制細胞的分裂增殖與死亡，從而維持機體的正常代謝和增殖。細胞周期調(diào)控失常時細胞會發(fā)生異常增殖，從而導致各種疾病的發(fā)生，甚至腫瘤的形成。當細胞發(fā)生DNA損傷后，細胞周期會停滯在某一時相為修復受損的DNA提供充足的時間，避免將該損傷遺傳至子代細胞。體內(nèi)和體外實驗發(fā)現(xiàn)，很多真菌毒素（如T-2毒素、桔霉素、赭曲霉毒素等）對細胞的毒性作用均表現(xiàn)為可以誘導細胞發(fā)生周期阻滯。此外，我們近期研究發(fā)現(xiàn)，ST處理能誘導人胃粘膜上皮細胞（GES-1）和人食管粘膜上皮細胞（Het-1A）發(fā)生G2期阻滯。研究表明ST可以誘導體外培養(yǎng)人肺癌細胞（A549）發(fā)生DNA損傷，但ST對正常人肺上皮細胞DNA損傷、細胞周期分布及其可能機制的研究尚未見報道。 鑒于此，為探討ST與人類肺癌發(fā)生的可能機制之間的關系，本研究選取人永生化支氣管上皮細胞（BEAS-2B）作為研究對象，觀察不同濃度ST處理對BEAS-2B細胞DNA損傷、周期分布的影響并從分子角度初步分析其可能的機制，以揭示ST對正常人肺上皮細胞的毒性作用。 方法：1細胞培養(yǎng) 正常人永生化支氣管上皮細胞（BEAS-2B）培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素的DMEM/F12混合培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2培養(yǎng)，細胞貼壁生長。2噻唑藍(MTT)比色法2.1單細胞懸液制備及細胞計數(shù) 取對數(shù)生長期的BEAS-2B細胞，用0.25%胰酶+0.02%EDTA常規(guī)消化，吹打混勻后取10μl滴于血細胞計數(shù)板上在顯微鏡下計數(shù)。計算公式為：細胞數(shù)（個細胞/ml）=（4個大格細胞總數(shù)/4）×104×稀釋倍數(shù)。2.2MTT比色法測定細胞存活率 用新鮮培養(yǎng)基調(diào)整BEAS-2B單細胞懸液濃度，使其終濃度為1×104個細胞/ml，接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔200μl。24h后吸掉上清液，加入低血清（1%）的DMEM/F12混合培養(yǎng)基，同步化處理24h后，更換新鮮的10%DMEM/F12混合培養(yǎng)基，同時給予ST，使其終濃度分別為0.06μM、0.15μM、0.3μM、0.6μM、1.5μM、3μM、6μM、12μM、24μM、48μM、96μM、192μM、240μM，溶劑對照組加入DMSO，每個濃度設6孔，繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)后24h每孔加入5mg/ml MTT20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸棄孔內(nèi)上清，每孔加入150μl DMSO，充分振蕩混勻，用多功能酶標儀測定各個孔在490nm處的OD值，并通過下列公式計算細胞存活率：細胞存活率(%)=（實驗組OD490值/對照組OD490值）×100%。3實驗分組與處理 根據(jù)MTT結(jié)果篩選出ST的最佳處理劑量，分別為6μM、12μM和24μM。取對數(shù)生長期的細胞，將其隨機分為溶劑對照組和實驗組。實驗組給予ST處理，其終濃度分別為6、12和24μM，溶劑對照組給予等體積的DMSO處理，繼續(xù)培養(yǎng)24h后常規(guī)消化，收集細胞，進行后續(xù)實驗，檢測相關指標。4流式細胞術(shù)（FCM）檢測細胞凋亡與細胞周期分布 ST處理24h后，分別收集溶劑對照組和各實驗組細胞，PBS洗滌2次，1000rpm離心5min，收集細胞，70%冰乙醇固定后檢測細胞周期的分布情況。5蛋白免疫印跡法（Western blot） 不同濃度ST作用于BEAS-2B細胞24h后，分別提取細胞總蛋白，經(jīng)BCA蛋白濃度測定試劑盒定量后，采用蛋白免疫印跡技術(shù)，檢測ST處理后正常人支氣管上皮細胞BEAS-2B中磷酸化型H2AX以及各細胞周期調(diào)控蛋白在蛋白水平的表達情況。6統(tǒng)計 所有實驗至少重復3次，采用SPSS13.0軟件進行單因素方差分析（analysis of variance, ANOVA），量效依賴關系采用雙變量相關與回歸分析，所有數(shù)據(jù)均用x±s表示，檢驗以P0.05為顯著性差異標準。 結(jié)果：1ST可以抑制BEAS-2B細胞增殖 本實驗應用MTT評價不同濃度ST對BEAS-2B細胞增殖的影響。結(jié)果表明，ST對BEAS-2B細胞的生長有明顯的抑制作用，經(jīng)ST處理24h后12、24、48、96、192、240μM ST處理組BEAS-2B細胞存活率均明顯低于溶劑對照組，與濃度呈負相關關系（r=-0.91P0.05）。2ST可以誘導體外培養(yǎng)BEAS-2B細胞DNA雙鏈斷裂 γ-H2AX的蛋白分子量為14KD，經(jīng)過SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜后，溶劑對照組和各實驗組均在14KD的位置出現(xiàn)了陽性條帶。以β-actin（42KD）為內(nèi)參照，經(jīng)定量分析后，結(jié)果顯示，6、12和24μM ST處理24h后，γ-H2AX的表達水平明顯高于溶劑對照組并且隨著ST濃度增加而升高。（r=0.914P0.05）。 以上結(jié)果提示，ST處理能夠誘導BEAS-2B細胞DNA雙鏈斷裂。3ST可誘導體外培養(yǎng)BEAS-2B細胞發(fā)生細胞周期阻滯 FCM結(jié)果顯示，6μM和12μM ST處理24h后，G0/G1期細胞比例減少，G2/M期細胞比例增多（P0.05）。24μM ST處理24h后，G0/G1期細胞比例下降，而S期和G2/M期細胞比例均增加（P0.05）。 以上結(jié)果提示，不同濃度的ST處理可以誘導BEAS-2B細胞發(fā)生不同的細胞周期阻滯。低濃度6μM和12μM ST處理能誘導BEAS-2B細胞發(fā)生G2/M期阻滯，而高濃度24μM ST處理則誘導其發(fā)生S期和G2/M期阻滯。4ST對細胞周期關鍵調(diào)控因子的影響4.1ST對G1期關鍵調(diào)控蛋白的影響4.1.1ST可以上調(diào)CyclinD1的蛋白表達水平 CyclinD1蛋白分子量為36KD，經(jīng)過SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜后，溶劑對照組和各ST處理組均在36KD的位置出現(xiàn)了陽性條帶。以β-actin（42KD）為內(nèi)參照，經(jīng)定量分析后，結(jié)果表明，不同濃度ST處理后CyclinD1的表達水平與溶劑對照組相比明顯升高，與濃度呈正相關關系，差異具有顯著性（r=0.992P0.05）。4.1.2ST對CDK4蛋白表達水平無明顯影響 CDK4的蛋白分子量是34KD，經(jīng)過SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜后，溶劑對照組和各實驗組均在34KD的位置出現(xiàn)了陽性條帶。以β-actin（42KD）作為內(nèi)參照，經(jīng)定量分析后，結(jié)果顯示，各實驗組CDK4的表達水平?jīng)]有明顯變化，與溶劑對照組相比差異無顯著性（P0.05）。4.1.3ST可以上調(diào)CyclinE1的蛋白表達水平 CyclinE1的蛋白分子量是47KD，經(jīng)過SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜后，溶劑對照組和各實驗組均在47KD的位置出現(xiàn)了陽性條帶。以β-actin（42KD）為內(nèi)參照，經(jīng)定量分析后，結(jié)果顯示，與溶劑對照組相比，不同濃度ST處理后CyclinE1的表達水平明顯升高（P0.05）。4.1.4ST可以上調(diào)CDK2的蛋白表達水平 CDK2的蛋白分子量是33KD，經(jīng)過SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜后，溶劑對照組和各ST處理組均在33KD的位置出現(xiàn)了陽性條帶。以β-actin（42KD）為內(nèi)參照，經(jīng)定量分析后，結(jié)果表明，不同濃度ST處理24h后，CDK2的表達水平明顯高于溶劑對照組（P0.05）。 綜合以上結(jié)果表明，ST處理能上調(diào)BEAS-2B細胞G1期調(diào)控蛋白的表達水平。4.2ST對S期和G2/M期關鍵調(diào)控蛋白的影響4.2.1ST可以下調(diào)CyclinA的蛋白表達水平 CyclinA的蛋白分子量是52KD，經(jīng)過SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜后，溶劑對照組和各實驗組均在52KD的位置出現(xiàn)了陽性條帶。以β-actin（42KD）為內(nèi)參照，經(jīng)定量分析后，結(jié)果顯示，除6μM處理組外，12μM和24μM ST處理組BEAS-2B細胞中CyclinA的表達水平較溶劑對照組相比明顯下降，與濃度呈負相關關系（r=-0.929P0.05）。與12μM處理組相比，24μM ST處理后CyclinA的表達水平降低更明顯（P0.05）。4.2.2ST可以下調(diào)CDK1的蛋白表達水平 CDK1的蛋白分子量為34KD，經(jīng)過SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜后，溶劑對照組和各ST處理組均在34KD的位置出現(xiàn)了陽性條帶。以β-actin（42KD）為內(nèi)參照，經(jīng)定量分析后，結(jié)果表明，與溶劑對照組相比，各ST處理組CDK1的表達水平隨濃度增高而降低（r=-0.941P0.05）。4.2.3ST可以上調(diào)CDK1的磷酸化水平 磷酸化型CDK1的蛋白分子量也是34KD，經(jīng)過SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜后，溶劑對照組和各實驗組均在34KD的位置出現(xiàn)了陽性條帶。以β-actin（42KD）為內(nèi)參照，經(jīng)定量分析后，結(jié)果顯示，6μM、12μM和24μM ST處理24h后，CDK1的磷酸化水平明顯升高，與濃度呈正相關關系（r=1P0.05）。4.2.4ST可以上調(diào)CyclinB1的蛋白表達水平 CyclinB1的蛋白分子量是48KD，經(jīng)過SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜后，溶劑對照組和各實驗組均在48KD的位置出現(xiàn)了陽性條帶。以β-actin（42KD）為內(nèi)參照，經(jīng)定量分析后，結(jié)果表明，與溶劑對照組相比，給予不同濃度ST作用24h后，CyclinB1的表達水平顯著升高（P0.05）。 綜合以上結(jié)果提示ST處理可以誘導BEAS-2B細胞S期和G2/M期細胞周期調(diào)控因子發(fā)生不同的變化。 結(jié)論：1ST可以誘導BEAS-2B細胞發(fā)生DNA雙鏈斷裂。2低濃度（6μM和12μM）ST處理能誘導BEAS-2B細胞發(fā)生G2/M期 阻滯，而高濃度（24μM）ST處理則誘導其發(fā)生S期和G2/M期阻滯。3不同濃度ST處理均可上調(diào)G1期調(diào)控蛋白（CyclinD1,CyclinE1和 CDK2）的表達，從而促進細胞由G1期進入S期。412和24μM ST處理可以下調(diào)CyclinA的表達，提示細胞通過S期的過 程可能會延遲，最終發(fā)生S期阻滯。5不同濃度ST處理可以下調(diào)CDK1的表達，，而上調(diào)CyclinB1的表達和 CDK1的磷酸化水平。這可能與ST誘導細胞發(fā)生G2/M期阻滯有關。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R114

【參考文獻】

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本文編號：1500394