本文關(guān)鍵詞：MAPK信號(hào)通路介導(dǎo)鋁致PC12細(xì)胞程序性壞死中作用的研究　出處：《山西醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的:通過加入凋亡抑制劑(z-VAD-fmk)、壞死抑制劑(Nec-1)以及P38、JNK、ERK相應(yīng)的抑制劑,探討MAPK信號(hào)通路在麥芽酚鋁PC12細(xì)胞程序性壞死中的作用。方法:1、細(xì)胞的培養(yǎng)及處理:(1)將PC12細(xì)胞在37℃、5%的CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。(2)取處于對(duì)數(shù)生長期的適量PC12細(xì)胞,用麥芽酚鋁(200μmol/L)對(duì)其進(jìn)行染毒24 h,分別設(shè)置空白對(duì)照組、溶劑對(duì)照組(DMSO組)、凋亡抑制劑(z-VAD-fmk)組、壞死抑制劑(Nec-1)組、麥芽酚鋁組,麥芽酚鋁+z-VAD-fmk組、麥芽酚鋁+Nec-1組。其中麥芽酚鋁+z-VAD-fmk組和麥芽酚鋁+Nec-1組在用染麥芽酚鋁處理之前,先加入凋亡、壞死抑制劑z-VAD-fmk和Nec-1各作用1 h,其濃度分別為20μmol/L和60μmol/L。(3)取處于對(duì)數(shù)生長期的適量PC12細(xì)胞,用麥芽酚鋁(200μmol/L)對(duì)其進(jìn)行染毒24 h,在染毒處理前,分別加入P38、JNK和ERK相應(yīng)的抑制劑(SB203580/SP600125/U0126)作用1h,其濃度分別為625 nmol/L、10μmol/L和15μmol/L。2、用CCK-8的方法測(cè)定各處理組的細(xì)胞活力,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率和壞死率,AO-EB法檢測(cè)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化,RT-PCR檢測(cè)P38、JNK和ERK的基因表達(dá)情況,并用Western-blot方法檢測(cè)P38、JNK、ERK、p-P38、p-JNK和p-ERK蛋白表達(dá)情況。結(jié)果:1、(1)AO-EB結(jié)果顯示:空白對(duì)照組和DMSO溶劑對(duì)照組核染色質(zhì)均著綠色并呈正常結(jié)構(gòu),與空白對(duì)照組比較,麥芽酚鋁組核染色質(zhì)著橘紅色并呈正常結(jié)構(gòu)或者呈固縮狀或著片段狀的細(xì)胞增多,即凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞增多。與麥芽酚鋁組比較,麥芽酚鋁+zvad-fmk組的凋亡細(xì)胞減少,核染色質(zhì)著橘紅色并呈縮狀的細(xì)胞減少,麥芽酚鋁+nec-1組的壞死細(xì)胞減少,核染色質(zhì)著橘紅色并呈正常結(jié)構(gòu)的細(xì)胞減少。(2)cck-8細(xì)胞活力測(cè)試:與空白對(duì)照組比較,麥芽酚鋁組、麥芽酚鋁+zvad-fmk組和麥芽酚鋁+nec-1組的細(xì)胞活力均下降了36.91%、13.8%和18.94%,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。與麥芽酚鋁組比較,麥芽酚鋁+zvad-fmk組和麥芽酚鋁+nec-1組的細(xì)胞活力均上升了23.11%和17.97%,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。(3)流式細(xì)胞儀測(cè)定:與空白對(duì)照組比較,zvad-fmk組、nec-1組、麥芽酚鋁組、麥芽酚鋁+zvad-fmk組和麥芽酚鋁+nec-1組的壞死率和凋亡率均降低,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);與麥芽酚鋁比較,麥芽酚鋁+zvad-fmk組和麥芽酚鋁+nec-1組的凋亡率和壞死率均降低,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。(4)rt-pcr檢測(cè):不同處理組間p38、jnk、erk基因的相對(duì)表達(dá)量有略微的變化,但是差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。(5)western-blot結(jié)果:麥芽酚鋁染毒pc12細(xì)胞后各組間p38、jnk、erk、p-jnk表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),p-p38、p-erk表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。與正常對(duì)照組相比,al(mal)3組、al(mal)3+zvad-fmk組和al(mal)3+nec-1組的p-p38表達(dá)量增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),與al(mal)3組比較,al(mal)3+zvad-fmk組和al(mal)3+nec-1組的p-p38表達(dá)量均下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);與正常對(duì)照組相比,al(mal)3組、al(mal)3+zvad-fmk組和al(mal)3+nec-1組的p-erk的表達(dá)量下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),與al(mal)3組比較,al(mal)3+zvad-fmk組和al(mal)3+nec-1組的表達(dá)量p-erk均增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。2、(1)ao-eb結(jié)果顯示:與染麥芽酚鋁組比較,麥芽酚鋁+sb203580抑制劑組的核染色質(zhì)著橘紅色的細(xì)胞減少;麥芽酚鋁+sp600125抑制劑組的核染色質(zhì)顏色無明顯變化;麥芽酚鋁+u0126抑制劑組的核染色質(zhì)著橘紅色的細(xì)胞增多。(2)cck-8細(xì)胞活力測(cè)試:與空白對(duì)照組比較,麥芽酚鋁組、麥芽酚鋁+sb203580抑制劑組、麥芽酚鋁+sp600125抑制劑組和麥芽酚鋁+u0126抑制劑組的細(xì)胞活力均下降,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);與染麥芽酚鋁組比較,麥芽酚鋁+sb203580抑制劑組的細(xì)胞活力上升,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);麥芽酚鋁+sp600125抑制劑組的細(xì)胞活力上升,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);麥芽酚鋁+u0126抑制劑組的細(xì)胞活力也下降,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(3)流式細(xì)胞儀測(cè)定:與空白對(duì)照組比較,麥芽酚鋁組、麥芽酚鋁+SB203580抑制劑組、麥芽酚鋁+SP600125抑制劑組和麥芽酚鋁+U0126抑制劑組的凋亡率和壞死率均上升,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與麥芽酚鋁比較,麥芽酚鋁+SB203580抑制劑組的凋亡率和壞死率均降低,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);麥芽酚鋁+SP600125抑制劑組的凋亡率和壞死率的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);麥芽酚鋁+U0126抑制劑組的凋亡率和壞死率均上升,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(4)Western-blot結(jié)果:加入P38抑制劑SB203580后,各個(gè)組之間的P38蛋白的相對(duì)表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);p-P38相對(duì)表達(dá)量的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),與空白對(duì)照組比較,SB203580抑制劑組、麥芽酚鋁組和麥芽酚鋁+SB203580抑制劑組的P38的磷酸化水平均發(fā)生變化,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),與染鋁組比較,SB203580抑制劑組和麥芽酚鋁+SB203580抑制劑組的P38的磷酸化水平均降低,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。加入JNK抑制劑SP600125后,JNK的表達(dá)量未見明顯差異,且無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);空白對(duì)照組、DMSO溶劑對(duì)照組、SP600125抑制劑組、麥芽酚鋁組和麥芽酚鋁+SP600125抑制劑組未見有磷酸化。加入ERK抑制劑U0126后,各個(gè)組之間的ERK蛋白的相對(duì)表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);p-ERK相對(duì)表達(dá)量的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),與空白對(duì)照組比較,U0126抑制劑組、麥芽酚鋁組和麥芽酚鋁+U0126抑制劑組的ERK的磷酸化水平均降低,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),與染鋁組比較,U0126抑制劑組和麥芽酚鋁+U0126抑制劑組的ERK磷酸化水平均降低,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:(1)麥芽酚鋁可以誘導(dǎo)PC12細(xì)胞發(fā)生凋亡和程序性壞死。(2)P38MAPK信號(hào)通路的激活和ERK信號(hào)通路的失活能夠促使PC12細(xì)胞發(fā)生凋亡和程序性壞死,JNK信號(hào)通路鋁致PC12細(xì)胞的凋亡和壞死過程中沒有影響。
[Abstract]:Objective : To investigate the effects of MAPK signaling pathway on apoptosis of maltol - induced PC12 cells by adding inhibitors of apoptosis ( z - VAD - fmk ) , necrosis inhibitor ( Nec - 1 ) and P38 , ERK and ERK . Methods : ( 1 ) PC12 cells were cultured in a constant temperature incubator at 37 鈩，

本文編號(hào)：1420118