發(fā)布時(shí)間：2018-01-13 13:33

  本文關(guān)鍵詞：電離輻射對(duì)SIK2基因表達(dá)的調(diào)控作用研究　出處：《南華大學(xué)》2013年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： SIK2 電離輻射 蛋白表達(dá) 轉(zhuǎn)錄水平 細(xì)胞周期 啟動(dòng)子活性

【摘要】：目的： 從mRNA、蛋白水平和啟動(dòng)子活性研究電離輻射對(duì)SIK2基因表達(dá)的影響、作用規(guī)律和相關(guān)機(jī)制，并構(gòu)建SIK2基因的真核表達(dá)載體，為深入探討SIK2的生物學(xué)功能及其在細(xì)胞放射損傷反應(yīng)中的作用提供信息和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法： 1.2、4和10Gy~(60)Coγ射線照射肝癌細(xì)胞HepG2后，實(shí)時(shí)定量PCR檢測照射后0、2、4、6、10、12h時(shí)間點(diǎn)的SIK2mRNA表達(dá)的時(shí)間效應(yīng)關(guān)系； 2.1、2、4、6、10Gy~(60)Coγ射線照射肝癌細(xì)胞HepG2后6h收集樣品，實(shí)時(shí)定量PCR檢測SIK2mRNA表達(dá)的劑量效應(yīng)關(guān)系； 3.2Gy和10Gy照射后，免疫印跡檢測SIK2蛋白隨照后時(shí)間表達(dá)水平的變化；流式細(xì)胞術(shù)分析照射后HepG2細(xì)胞的周期變化； 4. TdR雙阻斷法同步化HepG2細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測周期變化及實(shí)時(shí)定量PCR檢測相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的SIK2mRNA水平的變化； 5.構(gòu)建SIK2啟動(dòng)子重組報(bào)告質(zhì)粒，分析電離輻射誘導(dǎo)后啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的變化； 6.利用DNA重組技術(shù)構(gòu)建pCMV-Tag-2B-SIK2的真核表達(dá)質(zhì)粒。 結(jié)果： 1.利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)對(duì)輻射誘導(dǎo)SIK2基因表達(dá)的時(shí)間效應(yīng)和劑量效應(yīng)進(jìn)行分析，，結(jié)果表明射線照射對(duì)SIK2mRNA表達(dá)有誘導(dǎo)表達(dá)作用，但是與輻射劑量間沒有明顯的依賴關(guān)系（P0.05）；在時(shí)間效應(yīng)方面，發(fā)現(xiàn)2Gy、4Gy和10Gy照射后10h時(shí)間點(diǎn)，SIK2mRNA表達(dá)水平增加具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 0.05）。 2. Western Blot結(jié)果表明，2Gy照射后SIK2蛋白隨著照后時(shí)間的延伸而表達(dá)量增加；10Gy照射后表達(dá)變化趨勢同2Gy一樣，但增強(qiáng)的幅度相對(duì)較弱；1Gy、2Gy、4Gy、6Gy、10Gy照射后，SIK2蛋白表達(dá)水平隨劑量的增加而增加。 3.流式細(xì)胞術(shù)檢測2Gy和10Gy輻照后HepG2細(xì)胞均在10h左右出現(xiàn)了G2/M期阻滯高峰(P0.05)，與輻照后SIK2mRNA出現(xiàn)高峰值的時(shí)間點(diǎn)吻合；利用胸腺嘧啶雙阻斷同步化HepG2細(xì)胞后，實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測SIK2mRNA隨細(xì)胞周期進(jìn)程的變化，結(jié)果顯著變化不顯著。由此明確了電離輻射誘發(fā)SIK2mRNA表達(dá)增加不是細(xì)胞周期的變化的伴隨結(jié)果（P0.05）。 4.構(gòu)建了SIK2基因啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒，通過雙系統(tǒng)熒光報(bào)告基因活性分析，提示SIK2的啟動(dòng)子包含-2000~+119區(qū)域，可能還向上游繼續(xù)延伸；另外，-2000~+119范圍區(qū)間的啟動(dòng)子在輻射后10h的轉(zhuǎn)錄活性顯著增加(P 0.05)。 5.構(gòu)建了重組真核表達(dá)質(zhì)粒pCMV-Tag-2B-SIK2質(zhì)粒，通過順轉(zhuǎn)的方法鑒定質(zhì)粒在293T細(xì)胞內(nèi)成功表達(dá)，為SIK2后續(xù)功能和作用機(jī)制研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 結(jié)論： 1.電離輻射對(duì)SIK2mRNA表達(dá)有誘導(dǎo)作用，但無明顯的劑量依賴性。 2.~(60)Coγ射線誘導(dǎo)SIK2蛋白的表達(dá)水平增加，部分作用機(jī)制是照射后一定時(shí)間范圍內(nèi)SIK2啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的增加，由此使mRNA轉(zhuǎn)錄增加，進(jìn)一步加強(qiáng)了SIK2蛋白的表達(dá)水平。雖然SIK2參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)，但其mRNA在照射后期表達(dá)增加的原因與輻射誘導(dǎo)的G2/M期阻滯沒有關(guān)系。
[Abstract]:Objective: The effects of ionizing radiation on the expression of SIK2 gene were studied from the mRNAs, protein levels and promoter activity. The eukaryotic expression vector of SIK2 gene was constructed. To provide information and experimental basis for the further study of biological function of SIK2 and its role in cell radiation injury response. Methods: The HepG2 of hepatoma cells was irradiated with 1.2c4 and 10Gy ~ (60) Co 緯 -rays, and the real-time quantitative PCR was used to detect the 10 ~ (-) ~ (-) ~ (-) ~ (-) ~ (-) after irradiation. The time-effect relationship of SIK2mRNA expression at 12h; The samples were collected 6 hours after irradiation with 緯 -ray on hepatoma cell line (HepG2). The dose-effect relationship of SIK2mRNA expression was detected by real-time quantitative PCR. The expression level of SIK2 protein was detected by Western blot after irradiation of 3.2 Gy and 10 Gy, and the changes of HepG2 cell cycle after irradiation were analyzed by flow cytometry. 4. TdR double blocking method was used to synchronize HepG2 cells, flow cytometry was used to detect the cycle change and real-time quantitative PCR was used to detect the changes of SIK2mRNA level at the corresponding time points. 5. Construct SIK2 promoter recombination report plasmid, analyze the change of promoter transcription activity after ionizing radiation. 6. The eukaryotic expression plasmid of pCMV-Tag-2B-SIK2 was constructed by DNA recombination technique. Results: 1. The time and dose effects of radiation-induced SIK2 gene expression were analyzed by real-time quantitative PCR. The results showed that radiation irradiation could induce the expression of SIK2mRNA. However, there was no obvious dependence on the dose of radiation. In terms of time effect, it was found that the expression level of SIK2 mRNA increased significantly at 10 h after 2 Gy and 10 Gy irradiation (P 0.05). 2. The results of Western Blot showed that the expression of SIK2 protein increased with the extension of irradiation time. After 10 Gy irradiation, the change trend of expression was the same as that of 2 Gy, but the amplitude of enhancement was relatively weak. The expression level of sik2 protein increased with the increase of dose after 1 Gy 2 Gy 2 Gy 4 Gy 4 Gy 6 Gy 10 Gy irradiation. 3. Flow cytometry was used to detect the peak of G _ 2 / M arrest in HepG2 cells at about 10 h after 2 Gy and 10 Gy irradiation (P0.05). It coincides with the time point of high peak value of SIK2mRNA after irradiation. After the synchronization of HepG2 cells was blocked by thymidine, the changes of SIK2mRNA with cell cycle were detected by real-time quantitative PCR. The results showed that the increase of SIK2mRNA expression induced by ionizing radiation was not associated with the change of cell cycle. 4. The recombinant plasmid of promoter of SIK2 gene was constructed. The results showed that the promoter of SIK2 contained -2000 ~ 119 region by double-system fluorescence reporter gene activity analysis. May also continue upstream; In addition, the transcriptional activity of the promoter in the range from 2000 to 119 increased significantly at 10 h after irradiation (P 0.05). 5. The recombinant eukaryotic expression plasmid pCMV-Tag-2B-SIK2 plasmid was constructed and successfully expressed in 293T cells. It provides the experimental basis for the study of the function and mechanism of SIK2. Conclusion: 1. Ionizing radiation induced the expression of SIK2mRNA, but there was no significant dose-dependent effect. 2. The level of SIK2 protein expression induced by 60Co 緯 -ray was increased, partly by the increase of transcriptional activity of SIK2 promoter within a certain time range after irradiation. As a result, mRNA transcription was increased and the expression of SIK2 protein was further enhanced, although SIK2 was involved in cell cycle regulation. However, there was no relationship between the increase of mRNA expression and the G _ 2 / M phase arrest induced by radiation.
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R114

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本文編號(hào)：1419081