本文關(guān)鍵詞：氧化應(yīng)激與神經(jīng)炎癥在1-溴丙烷致大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷中的作用　出處：《山東大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：研究目的1-溴丙烷(1-Bromopropane,1-BP)是一種高揮發(fā)性有機(jī)化合物,在大氣中的半衰期約為15天,存在時(shí)間短。在中緯度地區(qū),1-BP臭氧消耗潛能(ozone depleting potential, ODP)較低約為0.013-0.018,故可作為臭氧消耗物質(zhì)(ozone-depleting solvents, ODS)如氯氟烴(chlorofluorocarbons, CFCs)和氫氯氟烴(hydrochlorofluorocarbons, HCFCs)的替代物使用。1-BP用于清洗金屬、塑料、電子和光學(xué)元件,還可作為脂肪、蠟和樹脂的溶劑,也是生產(chǎn)殺蟲劑、季胺類化合物、藥物和香料的中間產(chǎn)物。在人類病例和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,1-BP均能夠引起周圍神經(jīng)系統(tǒng)(peripheral nervous system, PNS)感覺和運(yùn)動(dòng)障礙,以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system, CNS)毒性如記憶損傷、疲勞和抑郁等。研究發(fā)現(xiàn)CNS癥狀的出現(xiàn)早于PNS,而且記憶損傷可以作為CNS毒性的指標(biāo)并在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中可以通過Morris水迷宮進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)量。所以通過記憶損傷研究1-BPCNS毒性的劑量反應(yīng)關(guān)系、可能涉及的毒性機(jī)制和生物標(biāo)志物對(duì)于1-BP中毒的早預(yù)防、早發(fā)現(xiàn)、早治療具有重要意義。對(duì)以記憶損傷為癥狀的神經(jīng)退行性疾病如阿爾茲海默病(Alzheimer's disease,AD)和帕金森病(Parkinson's disease, PD)的研究發(fā)現(xiàn),氧化應(yīng)激與記憶損傷可能具有病因?qū)W聯(lián)系。在CNS,谷胱甘肽(glutathione, GSH)是主要的抗氧化劑,對(duì)活性氧(reactive oxygen species, ROS)和外源化合物的解毒起到了重要的作用。因此,穩(wěn)定的GSH含量利于維持正常CNS功能,GSH耗竭可能導(dǎo)致記憶損傷。腦紅蛋白(neuroglobin, Ngb)是新發(fā)現(xiàn)的存在于大腦中的內(nèi)源性抗氧化劑,具有神經(jīng)保護(hù)作用,與認(rèn)知功能密切相關(guān)。Ngb含量和神經(jīng)保護(hù)作用的發(fā)揮也依賴于細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)。記憶功能依賴于神經(jīng)元的完整,記憶喪失往往伴隨著神經(jīng)元的損傷和丟失。神經(jīng)元的功能與星形膠質(zhì)細(xì)胞聯(lián)系緊密。氧化損傷能激活星形膠質(zhì)細(xì)胞,激活狀態(tài)的星形膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)釋放炎性介質(zhì)和ROS作用于神經(jīng)元并最終導(dǎo)致神經(jīng)元的死亡。ROS、前炎性因子如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-a, TNF-a)等都是星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活劑。本課題使用0,100,200,400,800mg/kg bw 1-BP對(duì)大鼠進(jìn)行染毒,觀察在1-BP致記憶損傷的過程中大腦皮層內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)(medial prefrontal cortex, mPFC)病理、Ngb含量、GSH代謝、星形膠質(zhì)細(xì)胞的變化及其與1-BP染毒劑量的關(guān)系,并通過基準(zhǔn)劑量法尋找1-BPCNS毒性中較敏感的效應(yīng)標(biāo)志物,探討氧化應(yīng)激和神經(jīng)炎癥在1-BP致CNS毒性中的作用。方法1.動(dòng)物處理：雄性Wistar大鼠(180-220g)85只,經(jīng)5d適應(yīng)性喂養(yǎng),大鼠被隨機(jī)分為5組(n=17),分別為對(duì)照組和1-BP染毒組(染毒劑量分別為100、200.400.800 mg/kg bw)。1-BP使用玉米油稀釋,大鼠經(jīng)灌胃連續(xù)給予1-BP 12d,對(duì)照組給予等體積玉米油,灌胃體積為0.2 ml/100g bw。實(shí)驗(yàn)第13d斷頭處死大鼠(每組10只),迅速剝離大腦皮層,放于-80℃待測(cè)；每組7只大鼠進(jìn)行心臟灌注,制備石蠟和冰凍切片。2.大鼠認(rèn)知功能測(cè)定：染毒第8d至12d,大鼠進(jìn)行Morris水迷宮測(cè)試。定位航行試驗(yàn)中逃避潛伏期和游泳路程能夠表現(xiàn)大鼠學(xué)習(xí)能力,空間探索試驗(yàn)中穿越平臺(tái)次數(shù)和目標(biāo)象限時(shí)間百分比可以反映大鼠記憶能力。3.大鼠mPFC神經(jīng)元數(shù)量檢測(cè)：免疫組化染色檢測(cè)神經(jīng)元標(biāo)志蛋白NeuN,選取mPFC邊緣前區(qū)(prelimbic area, PL)進(jìn)行神經(jīng)元計(jì)數(shù)。4.大腦皮層氧化應(yīng)激指標(biāo)：試劑盒檢測(cè)GSH、氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione, GSSG)、谷氨酸半胱氨酸連接酶(glutamate cysteine ligase, GCL)活性；western blot檢測(cè)脂質(zhì)過氧化標(biāo)志物,如4-羥基-2-壬烯醛(4-hydroxy-2-nonenal,4-HNE)和n-epsilon-己酰-賴氨酸(n-epsilon-hexanoyl-lysine, HEL)的蛋白質(zhì)加合物；western blot檢測(cè)Ngb含量變化。5.大腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞激活情況：免疫熒光檢測(cè)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glialfibrillary acidic protein, GFAP)(激活的標(biāo)志性蛋白)觀察大腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活情況；western blot檢測(cè)GFAP蛋白含量。6.大腦皮層前炎性因子的測(cè)定：qRT-PCR檢測(cè)前炎性因子TNF-a的mRNA含量。7.基準(zhǔn)劑量法計(jì)算效應(yīng)標(biāo)志物的基準(zhǔn)劑量(benchmark dose, BMD)和BMD的可信限下限(BMD lower confidence limit, BMDL)。結(jié)果1.1-BP染毒大鼠出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙：水迷宮結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,200、400和800 mg/kg bwl-BP組大鼠逃避潛伏期顯著增加、目標(biāo)象限時(shí)間百分比顯著減少(p0.05,p0.01),400和800 mg/kg bwl-BP組大鼠游泳路程顯著增加、穿越平臺(tái)次數(shù)顯著減少(p0.05,p0.01)。2.1-BP造成大鼠PL神經(jīng)元減少；與對(duì)照組相比,100、200、400和800 mg/kg bwl-BP組大鼠PL區(qū)域第5層神經(jīng)元數(shù)量呈劑量依賴性降低(p0.01),第2/3層和第6層無(wú)顯著變化。3.1-BP引起氧化應(yīng)激：與對(duì)照組相比,100、200、400和800 mg/kg bwl-BP組大鼠大腦皮層GSH含量、GSH/GSSG比值和GCL活性顯著減少(p0.01),GSSG含量顯著增加(p0.01)；1-BP染毒大鼠大腦皮層4-HNE和HEL氧化修飾蛋白含量顯著增加(p0.01)；200、400和800 mg/kg bwl-BP組大鼠大腦皮層Ngb含量呈劑量依賴性減少(p0.01)。4.1-BP導(dǎo)致大腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞顯著激活：免疫熒光GFAP染色顯示星形膠質(zhì)細(xì)胞顯著激活；與對(duì)照組相比,1-BP染毒組大鼠大腦皮層GFAP蛋白含量顯著升高(p0.01)。5.1-BP引起前炎性因子TNF-a表達(dá)上調(diào)：qRT-PCR結(jié)果顯示1-BP染毒組大鼠大腦皮層TNF-a的mRNA水平顯著增加(p0.05)。6.大腦皮層GSH/GSSG比值是反映1-BP CNS毒性較敏感的指標(biāo)。行為學(xué)效應(yīng)指標(biāo)逃避潛伏期(第4d)、游泳路程(第4d)、目標(biāo)象限時(shí)間百分比和穿越平臺(tái)次數(shù)的1-BP的BMDL分別為49.39、75.90、73.11和97.67 mg/kg.bw/day;生化效應(yīng)指標(biāo)大腦皮層GSH含量、GSH/GSSG比值和GCL活性的1-BP的BMDL分別為59.61、23.40和64.85 mg/kg.bw/day。結(jié)論1.1-BP能夠引起大鼠學(xué)習(xí)記憶損傷,這可能與1-BP導(dǎo)致記憶功能的重要參與者mPFC的PL第5層神經(jīng)元數(shù)量減少有關(guān)。2.1-BP能夠造成GSH耗竭、引起脂質(zhì)過氧化并降低對(duì)神經(jīng)元有保護(hù)作用的Ngb的含量。氧化損傷和神經(jīng)保護(hù)物質(zhì)的減少可能與神經(jīng)元丟失有關(guān)。3.1-BP引起星形膠質(zhì)細(xì)胞激活,前炎性因子TNF-a表達(dá)上調(diào)。神經(jīng)元丟失可能與激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放炎性介質(zhì)和ROS導(dǎo)致神經(jīng)元受損和死亡有關(guān)。4.大腦皮層GSH/GSSG比值是反映1-BP CNS毒性較敏感的指標(biāo)。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R114

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