本文關(guān)鍵詞：miRNA200c-vimentin信號(hào)通路在鄰苯二甲酸單丁酯刺激類固醇激素合成中的作用　出處：《南京醫(yī)科大學(xué)》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)在環(huán)境中普遍存在,人體可通過飲水、進(jìn)食、皮膚接觸和呼吸道等途徑接觸該化學(xué)物質(zhì)。DBP大量存在于人們的消費(fèi)產(chǎn)品中,是使用量最大、污染最嚴(yán)重的鄰苯二甲酸酯(PAEs)之一。大量研究表明,DBP作為環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(EDCs)可引起嚙齒類動(dòng)物的生殖毒性。DBP可以影響類固醇激素的合成而損害雄性生殖功能。DBP主要通過代謝為其單體鄰苯二甲酸單丁酯(MBP)發(fā)揮抗雄激素作用。膽固醇是類固醇激素合成的前體物質(zhì),為類固醇激素合成的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。膽固醇自胞漿轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體外膜的過程對(duì)類固醇激素的合成起著重要的調(diào)節(jié)作用。研究表明,中間絲蛋白作為細(xì)胞骨架的重要組成成分參與了類固醇激素的合成。波形蛋白(vimentin)是中間絲細(xì)胞骨架蛋白的重要成分之一,參與了膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)過程。然而,以往對(duì)vimentin在DBP/MBP干擾類固醇激素合成中的作用研究甚少。另外,較低劑量DBP/MBP對(duì)類固醇激素合成的影響的報(bào)道也很少。本研究以小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞(MLTC-1)和小鼠腎上腺皮質(zhì)瘤細(xì)胞(Y1)為模型探討低水平MBP暴露對(duì)vimentin及類固醇激素合成相關(guān)蛋白表達(dá)的影響以及miRNA200c對(duì)vimentin的調(diào)控機(jī)制,探討miRNA200c-vimentin信號(hào)通路在低劑量MBP刺激類固醇激素合成中的作用。第一部分miRNA200c-vimentin信號(hào)通路在MBP刺激MLTC-1細(xì)胞類固醇激素合成中的作用目的觀察不同劑量MBP對(duì)MLTC-1細(xì)胞vimentin和類固醇激素合成的影響,探討miRNA200c-vimentin信號(hào)通路在低劑量MBP刺激MLTC-1細(xì)胞類固醇激素合成中的作用。方法1.采用小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞株(MLTC-1)作為體外培養(yǎng)模型。該細(xì)胞的功能與從正常睪丸組織分離的Leydig細(xì)胞相似,但合成睪酮量較少,hCG或CT等刺激后,類固醇激素的合成能力增加,主要合成的類固醇激素是孕酮。2. MLTC-1細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)24h或48h, MTT法測(cè)定MBP對(duì)MLTC-1細(xì)胞活力的影響,確定MBP的處理劑量。3. MLTC-1細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)24h,不同濃度MBP處理MLTC-1細(xì)胞24h,然后在培養(yǎng)液中加入hCG (0.1U/L)刺激4h,用放射免疫法(RIA)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液上清中的孕酮含量。4. Real-time RT-PCR法測(cè)定MLTC-1細(xì)胞中miRNA200c和vimentin mRNA表達(dá)水平。5.蛋白印跡法(western blot)測(cè)定MLTC-1細(xì)胞中類固醇激素合成相關(guān)因子類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白(StAR)、P450膽固醇側(cè)鏈裂解酶(P450scc)、3β-羥基類固醇脫氫酶(3β-HSD)以及細(xì)胞骨架蛋白vimentin和tubulin蛋白表達(dá)水平。6.應(yīng)用RNAi技術(shù)下調(diào)vimentin的表達(dá)水平,再用MBP (10-7M)刺激,觀察MLTC-1細(xì)胞類固醇激素合成的改變。7.應(yīng)用RNAi技術(shù)抑制或過表達(dá)miRNA200c的表達(dá)水平,再用MBP(10-7M)刺激,分別觀察MLTC-1細(xì)胞vimentin表達(dá)以及類固醇激素合成的改變。結(jié)果1.MBP在10-3 M時(shí)對(duì)細(xì)胞活性產(chǎn)生抑制效應(yīng),而在低于10-3 M時(shí)對(duì)細(xì)胞活性未觀察到顯著性影響。2.MBP處理MLTC-1細(xì)胞24h后hCG刺激4h,與對(duì)照組相比,孕酮水平在MBP10-7M和10-6M時(shí)上升(P0.05)3. Western blot檢測(cè)結(jié)果表明,不同劑量MBP(10-7-10-4 M)作用于MLTC-1細(xì)胞24h后,與對(duì)照組相比,vimentin蛋白在MBP 10-7和10-6M時(shí)表達(dá)量明顯增加。StAR蛋白在MBP10-7和10-6M時(shí)表達(dá)量有所升高。而在其它劑量組,vimentin和StAR蛋白表達(dá)沒有明顯差異。類固醇合成相關(guān)蛋白tubulin、β-actin、P450scc和3p-HSD蛋白表達(dá)水平在不同劑量MBP作用下沒有顯著性差異。4.用si-vim處理MLTC-1細(xì)胞后,vimentin的表達(dá)降低,同時(shí)檢測(cè)到孕酮合成量減少；用si-vim抑制MLTC-1細(xì)胞vimentin表達(dá)后,再用MBP(10-7M)刺激MLTC-1細(xì)胞,vimentin蛋白表達(dá)上升,同時(shí)孕酮合成量增加(P0.05)。5.不同劑量MBP (10-7-10-4M)作用于MLTC-1細(xì)胞24h后,與對(duì)照組相比,miRNA200c在MBP 10-7、10-6和10-5M時(shí)表達(dá)水平降低(P0.05)。6.抑制MLTC-1細(xì)胞miRNA200c表達(dá)后,vimentin蛋白和mRNA表達(dá)水平上升,同時(shí)孕酮合成升高大約30%(P0.05)7. MLTC-1細(xì)胞miRNA200c過表達(dá)后,vimentin蛋白表達(dá)下降,同時(shí)孕酮合成降低；細(xì)胞在MBP 10-7M刺激下,vimentin蛋白表達(dá)水平回復(fù),同時(shí)孕酮合成上升(P0.05)。結(jié)論1.MBP(10-7和10-6 M)顯著增加MLTC-1細(xì)胞類固醇激素的合成。2. miRNA200c-vimentin信號(hào)通路在低劑量MBP刺激MLTC-1細(xì)胞類固醇激素合成中發(fā)揮著重要的作用。第二部分miRNA200c-vimentin信號(hào)通路在MBP刺激Y1細(xì)胞類固醇激素合成中的作用目的觀察MBP對(duì)Y1細(xì)胞vimentin和類固醇激素合成的影響,探討miRNA200c-vimentin信號(hào)通路在低劑量MBP刺激Y1細(xì)胞類固醇激素合成中的作用。方法1.采用小鼠腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞(Y1)作為體外培養(yǎng)模型。該細(xì)胞對(duì)ACTH或forskolin反應(yīng)性與腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞相似,合成的類固醇激素主要為孕酮。2.Y1細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)24h和48h, MTT法測(cè)定MBP對(duì)Y1細(xì)胞活力的影響,確定MBP處理劑量。3.Y1細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)24h,不同濃度MBP處理Y1細(xì)胞24h,然后在培養(yǎng)液中加入毛喉素(forskolin)刺激12h,收集細(xì)胞上清,用放射免疫法(RIA)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液上清中的孕酮含量。4. Real-time RT-PCR法測(cè)定Y1細(xì)胞中miRNA200c和vimentin mRNA表達(dá)水平。5.蛋白印跡法(western blot)測(cè)定Y1細(xì)胞中類固醇激素合成相關(guān)因子類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白(StAR)、P450膽固醇側(cè)鏈裂解酶(P450scc)、3β-羥基類固醇脫氫酶(3β-HSD)以及細(xì)胞骨架蛋白vimentin和tubulin蛋白表達(dá)水平。6.應(yīng)用RNAi技術(shù)下調(diào)vimentin的表達(dá)水平,再用MBP (10-7M)刺激Y1細(xì)胞,觀察Y1細(xì)胞類固醇激素合成的改變。7.應(yīng)用RNAi技術(shù)抑制或過表達(dá)miRNA200c的表達(dá)水平,再用MBP(10-7M)刺激,觀察Y1細(xì)胞vimentin表達(dá)以及類固醇激素合成的改變。結(jié)果1.MBP在10-3 M時(shí)對(duì)細(xì)胞活性產(chǎn)生抑制效應(yīng),而在低于10-3 M時(shí)對(duì)細(xì)胞活性未觀察到顯著性影響。2.MBP處理Y1細(xì)胞24h后,毛喉素(forskolin)刺激12h,與對(duì)照組相比,孕酮水平在MBP 10-7 M時(shí)上升(P0.05)。3. Western blot檢測(cè)結(jié)果表明,不同劑量MBP (10-7-10-4M)作用于Yl細(xì)胞24h后,與對(duì)照組相比,vimentin蛋白在MBP 10-7和10-6M時(shí)表達(dá)量明顯增加。StAR蛋白在MBP 10-7和10-6 M時(shí)表達(dá)量有所升高。而在其它劑量組,vimentin蛋白和StAR蛋白表達(dá)沒有明顯差異。類固醇合成相關(guān)蛋白tubulin、β-actin、P450scc和3β-HSD蛋白表達(dá)水平在不同劑量MBP作用下沒有顯著性差異。4.用si-vim處理細(xì)胞后,vimentin的表達(dá)明顯降低,同時(shí)觀察到Y(jié)1細(xì)胞的孕酮合成量減少；用si-vim抑制Y1細(xì)胞vimentin表達(dá)后,再用MBP(10-7M)刺激Y1細(xì)胞,vimentin蛋白表達(dá)上升,同時(shí)孕酮合成量增加(P0.05)。5.不同劑量組MBP(10-7-10-4M)作用于Y1細(xì)胞24h后,與對(duì)照組相比,miRNA200c在MBP 10-7、10-6和10-5M時(shí)表達(dá)水平降低(P0.05)。6.抑制Y1細(xì)胞miRNA200c表達(dá)后, vimentin蛋白和mRNA表達(dá)水平上升,同時(shí)孕酮合成升高(P0.05)。7.Y1細(xì)胞miRNA200c過表達(dá)后,vimentin蛋白表達(dá)下降,孕酮合成降低；miRNA200c過表達(dá)后細(xì)胞在MBP 10-7M刺激下,vimentin蛋白表達(dá)水平回復(fù),同時(shí)孕酮合成上升(P0.05)。結(jié)論1.MBP(10-7和10-6M)顯著增加Y1細(xì)胞類固醇激素的合成。2. miRNA200c-vimentin信號(hào)通路在低劑量MBP刺激Y1細(xì)胞類固醇激素合成中有著重要的作用。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R114

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1322433