本文關鍵詞：利用表達代謝酶的細胞系測試間接致突變物作用特征　出處：《南方醫(yī)科大學》2016年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：微核試驗是常用的一種以染色體丟失和斷裂為遺傳學終點的細胞遺傳學方法,其常用于研究外源化學物的細胞遺傳毒性,并結(jié)合著絲粒免疫熒光標記技術分析外源化學物遺傳毒作用機制的類別。由于動物福利倫理的要求和動物試驗的“3R”原則(優(yōu)化、減少、替代),體外微核試驗逐漸成為化學物遺傳毒作用的一個重要的初篩試驗方法。體外微核試驗目前常用的模型是人類淋巴細胞微核試驗和哺乳動物細胞系微核試驗；前者優(yōu)點是靶細胞由人類來源,后者屬永生化細胞,增殖能力強、核型穩(wěn)定、試驗重現(xiàn)性佳。采用永生化哺乳動物細胞系的微核試驗的標準程序包括如下暴露/恢復時程：受試細胞短時暴露(≤0.5個細胞周期)于受試化合物,繼以較長恢復時間(≥1.5個細胞周期)；若結(jié)果為陰性或可疑陽性,則進行第二個程序的試驗；延長暴露時間(≥2個細胞周期)至細胞收獲(無恢復時間)。這樣包括兩個試驗程序的方案可最大限度減少細胞遺傳毒物漏檢(假陰性)的幾率。已有報道,第一、第二個試驗程序分別有利于檢測斷裂劑和致非整倍體劑。許多重要的環(huán)境致突變物、致癌物須經(jīng)生物轉(zhuǎn)化酶代謝活化后才能發(fā)揮其遺傳毒作用,所以體外微核試驗中包括添加代謝活化系統(tǒng)以彌補標準測試細胞中生物轉(zhuǎn)化酶活性缺失的試驗。經(jīng)典的外源性代謝活化體系是由酶誘導劑Aroclor 1254處理的大鼠制備的肝微粒體與體外NADPH再生系統(tǒng)構(gòu)成的代謝活化體系(S9混合液),常用于化學物的體外遺傳毒性試驗中。然而,S9混合液缺乏細胞色素P450 (CYP) 1B1和CYP2E1以及參與大量致癌物生物活化的多種非CYP酶系,對于一些需此類酶系活化的間接致突變物的檢測并不適用；S9混合液也有酶活性不穩(wěn)定和致細胞脂質(zhì)過氧化改變等缺點,所以,S9在體外微核試驗中暴露時間受限。為克服S9混合液的不足,在遺傳毒性機制研究中可使用表達人類生物轉(zhuǎn)化酶的細胞系來代替細胞外代謝活化系統(tǒng)。為了印證文獻報道的斷裂劑和致非整倍體劑對染毒時程的不同選擇性。本課題的第一部分是采用已知的染色體斷裂劑(絲裂霉素C和博來霉素)和致非整倍體劑(秋水仙堿和長春花堿)對中國地鼠肺成纖維(V79)細胞染毒,染毒方案分別采取以下不同暴露／恢復時程：0h／24h(陰性對照)、3h/21h、6h/18h、 12h/12h、18h/6h和24h／0h,然后檢測各組微核細胞率。然而,重組表達生物轉(zhuǎn)化酶的受試細胞對間接致突變物的代謝活化是一個可能出現(xiàn)酶蛋白飽和現(xiàn)象及需要時間的過程,其是否影響暴露／恢復時程與所測試受試物微核形成機制的特定關系則尚無報道。本課題的第二部分則使用共表達人CYP2E1酶和人硫酸基轉(zhuǎn)移酶(SULT) 1A1酶的重組中國地鼠肺成纖維(V79)細胞(V79-hCYP2E1-hSULT1A1)來初步探討數(shù)種需生物轉(zhuǎn)化酶代謝活化的外源化學物的遺傳毒作用機制。其中,卜甲基芘經(jīng)CYP2E1酶和SULT1A1酶先后兩步生物轉(zhuǎn)化反應而活化,1-羥甲基芘經(jīng)SULT1A1酶活化形成致突變物(二者未經(jīng)代謝活化均無遺傳毒性)；氫醌、兒茶酚和1,2,4-三羥基苯則被CYP2E1酶活化成活性增強的致突變物。微核試驗方法同以上第一部分,探討暴露／恢復時程對這些受試物誘發(fā)微核作用的影響,此外還分析各受試物誘導細胞有絲分裂阻滯的作用(作為微管毒性的標志),為判斷受試物可能的遺傳毒作用機制(斷裂劑或致非整倍體劑)提供線索。多氯聯(lián)苯(Polychlorinated biphenyls, PCBs)是一組持久性有機污染物,至今仍普遍存在于全球環(huán)境中,且在高暴露人群體內(nèi)有一定量的蓄積。2013年國際癌癥研究機構(gòu)(IARC)己把PCBs確認為人類致癌物。CYP2E1是一個主要在肝臟表達的重要生物轉(zhuǎn)化酶,可催化許多小分子外源化學物的代謝,包括苯、苯酚及某些短鏈鹵代脂肪烴等化學物。本課題組以微核試驗和1Hpγt基因突變試驗為遺傳學終點的前期研究發(fā)現(xiàn),低氯化多氯聯(lián)苯經(jīng)人CYP2E1代謝活化成為具有遺傳毒性的代謝物,其作用明顯強于另外幾個CYP酶。小鼠是一個毒理學試驗中常用的動物種屬,但是小鼠CYP2E1酶對PCBs的代謝活化作用未見報道。為進一步探討CYP2E1酶對PCBs代謝活化能力的種屬差異性,本課題選取前期研究中以不同(遞減)強度誘發(fā)V79-hCYP2E1-hSULT1A1細胞微核形成的4種PCB化合物(PCB 20、PCB 18、PCB 5和PCB 28),N-亞硝基二甲基胺(N-nitrosodimethylamine, NDMA,依賴于CYP2E1活化的強致突變物)作為參考性己知間接致突變物探討這5種化學物誘發(fā)表達小鼠CYP2E1酶的V79重組細胞(V79-mCYP2E1)和V79-hCYP2E1-hSULT1A1細胞Hprt基因座突變作用,比較兩個種屬CYP2E1酶代謝活化作用的選擇性和活化強度的差異,以期為相關動物試驗的物種選擇提供依據(jù)。目的1.印證不同外源化學物誘發(fā)哺乳動物細胞微核形成所需敏感的暴露／恢復時程與微核形成機制(斷裂作用與致非整倍體作用)之間的關系。2.研究需經(jīng)生物轉(zhuǎn)化酶代謝活化的幾個外源化學物在不同暴露／恢復時程條件下誘導重組表達生物轉(zhuǎn)化酶的哺乳動物細胞系微核的作用,從而明確代謝環(huán)節(jié)是否構(gòu)成對微核形成的時程毒理學的影響,以及相關間接遺傳毒物作用的可能機制。3.探討人和小鼠兩個種屬的CYP2E1酶分別對NDMA和4種PCBs誘發(fā)基因突變的作用,以闡明這兩個種屬的CYP2E1對PCBs代謝活化作用的相似度或差異性。方法1.細胞增殖／存活測定(CCK-8試驗)CCK-8試驗方法是測定細胞增殖和活性的常用方法。CCK-8試劑含有WST-8(2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽),其在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鮪硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)的作用下被細胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物(Formazandye)。生成的甲瓚物的數(shù)量與活細胞的數(shù)量成正比,通過酶標儀于450nm處測定光密度(Optical density, OD)而定量。本研究中以各受試物處理V79和V79-hCYP2E1-hSULT1A1細胞的暴露／恢復時程按照以下方案進行：0h／24h(陰性對照),3h/21h,6h/18h,12h/12h,18h/6h和24h／0h。加入CCK-8試劑后用酶標儀于450nm波長檢測溶液光密度,以各暴露組與對照組光密度的比較表示細胞增殖／存活率。2.微核試驗微核試驗是檢查細胞染色體可遺傳改變的一種遺傳毒性試驗方法。V79細胞和V79-hCYP2E1-hSULT1A1細胞接種24h后進行染毒,暴露／恢復時程與CCK-8試驗方法相符。選擇受試化合物濃度的原則：多數(shù)暴露／恢復時程條件下微核細胞率增高具有統(tǒng)計學意義,同時細胞毒作用盡量低或完全沒有；每個受試物設置2個相差一倍的濃度。對于受試物可被SULT1A1代謝減毒(氫醌、兒茶酚及三羥基苯)的試驗,V79-hCYP2E1-hSULT1A1細胞以SULT1抑制劑五氯酚(PCP)處理(染毒前2h加入并一直存在于培養(yǎng)液中,直至細胞收獲)。各培養(yǎng)瓶中的細胞以胰蛋白酶消化的方式收獲,經(jīng)過低滲、固定、滴片,最后用姬姆薩染液染色。每個處理組設2個重復試驗,在光學顯微鏡油鏡下每個試驗隨機觀察1000個完整細胞,計數(shù)至少含一個微核的細胞數(shù),以獲得微核細胞率。3.有絲分裂細胞率的分析細胞紡錘體損傷的一個突出表現(xiàn)就是有絲分裂阻滯,即細胞增殖不受明顯影響的情況下出現(xiàn)的細胞有絲分裂頻率增高。細胞接種于放置4.5cm2圓形爬片的6孔板中,于24h染毒,受試物為氫醌、兒茶酚或三羥基苯時1CP(10μM)于染毒前2h加入,直至染毒結(jié)束。細胞經(jīng)固定,以姬姆薩染色液染色,然后將爬片倒扣于載玻片。每組設置2個重復樣本。光學顯微鏡油鏡下每個試驗隨機觀察1000個完整細胞,計數(shù)有絲分裂期細胞并計算其所占比例,即有絲分裂細胞率。4.SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)及免疫印跡(Western Blot)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和免疫印跡是蛋白質(zhì)電泳分離和定量分析的常用方法。實驗流程如下：制備蛋白樣品(BCA法測蛋白濃度)、SDS-PAGE(上樣量為50μg蛋白質(zhì)、容量1mL)、電轉(zhuǎn)移(冰浴轉(zhuǎn)膜)、封閉、一抗孵育(4℃)、TBST洗滌、二抗孵育(常溫)、TBST洗滌、電化學顯色反應、分析。5. Hprt基因座致突變試驗細胞在Hprt(次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶)位點的正向突變(即獲得對6-巰基嘌呤的抗性)是其所觀察的遺傳毒作用終點。細胞以1.5×106個/瓶(182cm2,25mL培養(yǎng)液)的密度接種,24h后,加入各受試化合物,染毒24h后換液。繼續(xù)培養(yǎng)2d后,以胰蛋白酶消化收集細胞(各組細胞數(shù)占對照組細胞數(shù)的百分比作為受試物細胞毒性的指標)后以1×106個/皿(137cm2,25mL培養(yǎng)液)密度傳代。進一步培養(yǎng)3d后,再一次傳代并以5×105個/皿的密度接種細胞于含有6-巰基嘌呤(7μg/mL)的選擇性培養(yǎng)液(每個培養(yǎng)皿收集的細胞傳代于含選擇性培養(yǎng)液的4個培養(yǎng)皿)；另外以100個/皿的密度接種細胞于3個含正常培養(yǎng)液的9.6 cm2培養(yǎng)皿,以測定細胞的集落形成率。8d后試驗終止,經(jīng)固定和姬姆薩染色,計數(shù)每個培養(yǎng)皿細胞集落的數(shù)目,以平行接種的各培養(yǎng)皿所得均數(shù)作為相應的觀察值(集落形成率和突變細胞率)。6.統(tǒng)計學分析CCK-8試驗采用方差分析法對不同處理組與對照組進行統(tǒng)計學檢驗。微核試驗和有絲分裂細胞率分析試驗中每個處理組設有2個重復測試,組內(nèi)數(shù)據(jù)合并后采用χ2檢驗對不同處理組進行統(tǒng)計學檢驗。Hprt基因突變試驗中各處理組與對照組突變細胞率的比較采用Fisher確切概率法。所有統(tǒng)計結(jié)果以P0.05判斷為差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)果1.斷裂劑絲裂霉素C (MMC)和博萊霉素(BLM)誘發(fā)V79細胞微核的作用隨暴露／恢復時程變化呈現(xiàn)雙相反應：首先隨著暴露時間延長微核細胞率逐漸增高,于12h／12h達到峰值,然后逐漸下降。而致非整倍體劑秋水仙素(COL)和長春花堿(VBL)誘發(fā)微核的作用則一直隨暴露時間延長而增高,于24h／0h達最高值。此外COL和VBL可誘發(fā)V79細胞有絲分裂阻滯,而MMC和BLM無此作用；與之對應的是前二者對細胞存活／生長具有一定抑制作用,而后二者沒有明顯影響。以上結(jié)果對后續(xù)利用表達生物轉(zhuǎn)化酶細胞微核試驗染毒過程的探索提供了適當參考。2.與COL和VBL對V79細胞的作用類似,1-甲基芘(1-MP)和1-羥甲基芘(1-HMP)對V79-hCYP2E1-hSULT1A1細胞誘發(fā)微核的作用在暴露／恢復時程為18h／6h時達到峰值；苯的羥化代謝物對V79-hCYP2E1-hSULT1A1細胞的作用則與斷裂劑對V79細胞的作用相似：兒茶酚(CAT)和1,2,4-三羥基苯(THB)在6h／18h時誘發(fā)微核作用最強,氫醌(HQ)作用的峰值出現(xiàn)在暴露時間稍長的時程。此外,1-MP和1-HMP對V79-hCYP2E1-hSULT1A1細胞呈現(xiàn)一定細胞毒作用,且隨暴露時間延長而增強；相反,HQ、CAT和THB則沒有明顯的細胞毒作用。并且,1-HMP和1-MP誘發(fā)V79-hCYP2E1-hSULT1A1細胞明顯的有絲分裂阻滯,而CAT、THB和HQ則無明顯作用。在各暴露／恢復時程條件下,各受試物的高劑量組誘發(fā)微核和有絲分裂阻滯的作用均強于低劑量組。3.蛋白印跡試驗結(jié)果顯示,V79-mCYP2E1相比于V79-hCYP2E1-hSULT1A1細胞中CYP2E1蛋白表達水平略低。五個受試化合物對V79細胞均未誘發(fā)基因突變；然而,NDMA對V79-hCYP2E1-hSULT1A1細胞和V79-mCYP2E1細胞均強烈誘發(fā)基因突變,且呈明顯的濃度-效應關系,PCB 5和PCB 18可明顯誘發(fā)V79-hCYP2E1-hSULT1A1細胞基因突變,但對V79-mCYP2E1細胞僅有微弱的致突變作用。PCB 20和PCB 28對后兩種受試細胞僅有微弱的致突變作用。結(jié)論1.與既往報道相似,不同暴露／恢復時程下,斷裂劑和致非整倍體劑誘發(fā)V79細胞微核的作用有明顯差異,分別于不同時程(12h／12h和24h／0h)達到其作用的峰值。結(jié)果提示在采用細胞系的體外微核試驗中,短暴露／長恢復時程可能有利于檢測斷裂劑的作用,而長暴露／短(或零)恢復則更易檢出致非整倍體劑。2.根據(jù)以上斷裂劑和致非整倍體劑誘發(fā)培養(yǎng)細胞微核作用與暴露/恢復時程的關系,結(jié)合不同受試物對V79-hCYP2E1-hSULT1A1誘發(fā)微核及有絲分裂阻滯作用的差異,可認為兩個烷基化芘化合物(1-HMP和1-MP)經(jīng)CYP2E1酶和／或SULT1A1酶代謝活化成為具有微管毒性及致非整倍體毒性的代謝物；而苯的羥化代謝物中,CAT和THB具有斷裂作用,HQ則可能兼有斷裂作用與致非整倍體作用。代謝活化雖有時間依賴性,但上述間接致突變物誘發(fā)微核作用的時程與直接致突變物相比并不延遲,所以細胞系微核試驗的標準程序至少對本研究采用的細胞內(nèi)代謝活化模型是適用的。3.受試化合物對表達不同種屬CYP2E1的V79重組細胞致突變作用在強度和效能上的差異,特別明顯表現(xiàn)在PCB 18和PCB 5對上述兩種受試細胞致突變作用的巨大差異,這不能完全由相關生物轉(zhuǎn)化酶表達水平的差異較小來解釋,而主要與酶蛋白的種屬差異性有關。因此,小鼠作為分析PCBs遺傳毒作用的體內(nèi)試驗模型可能并不符合特異性代謝活化的條件,而對于其他常用的體內(nèi)試驗動物模型(大鼠、兔)是否適用仍需進一步探討。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R114

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