發(fā)布時(shí)間：2017-12-20 18:03

  本文關(guān)鍵詞：利用表達(dá)代謝酶的細(xì)胞系測(cè)試間接致突變物作用特征　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：微核試驗(yàn)是常用的一種以染色體丟失和斷裂為遺傳學(xué)終點(diǎn)的細(xì)胞遺傳學(xué)方法,其常用于研究外源化學(xué)物的細(xì)胞遺傳毒性,并結(jié)合著絲粒免疫熒光標(biāo)記技術(shù)分析外源化學(xué)物遺傳毒作用機(jī)制的類別。由于動(dòng)物福利倫理的要求和動(dòng)物試驗(yàn)的“3R”原則(優(yōu)化、減少、替代),體外微核試驗(yàn)逐漸成為化學(xué)物遺傳毒作用的一個(gè)重要的初篩試驗(yàn)方法。體外微核試驗(yàn)?zāi)壳俺Ｓ玫哪Ｐ褪侨祟惲馨图?xì)胞微核試驗(yàn)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞系微核試驗(yàn)；前者優(yōu)點(diǎn)是靶細(xì)胞由人類來(lái)源,后者屬永生化細(xì)胞,增殖能力強(qiáng)、核型穩(wěn)定、試驗(yàn)重現(xiàn)性佳。采用永生化哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的微核試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)程序包括如下暴露/恢復(fù)時(shí)程：受試細(xì)胞短時(shí)暴露(≤0.5個(gè)細(xì)胞周期)于受試化合物,繼以較長(zhǎng)恢復(fù)時(shí)間(≥1.5個(gè)細(xì)胞周期)；若結(jié)果為陰性或可疑陽(yáng)性,則進(jìn)行第二個(gè)程序的試驗(yàn)；延長(zhǎng)暴露時(shí)間(≥2個(gè)細(xì)胞周期)至細(xì)胞收獲(無(wú)恢復(fù)時(shí)間)。這樣包括兩個(gè)試驗(yàn)程序的方案可最大限度減少細(xì)胞遺傳毒物漏檢(假陰性)的幾率。已有報(bào)道,第一、第二個(gè)試驗(yàn)程序分別有利于檢測(cè)斷裂劑和致非整倍體劑。許多重要的環(huán)境致突變物、致癌物須經(jīng)生物轉(zhuǎn)化酶代謝活化后才能發(fā)揮其遺傳毒作用,所以體外微核試驗(yàn)中包括添加代謝活化系統(tǒng)以彌補(bǔ)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試細(xì)胞中生物轉(zhuǎn)化酶活性缺失的試驗(yàn)。經(jīng)典的外源性代謝活化體系是由酶誘導(dǎo)劑Aroclor 1254處理的大鼠制備的肝微粒體與體外NADPH再生系統(tǒng)構(gòu)成的代謝活化體系(S9混合液),常用于化學(xué)物的體外遺傳毒性試驗(yàn)中。然而,S9混合液缺乏細(xì)胞色素P450 (CYP) 1B1和CYP2E1以及參與大量致癌物生物活化的多種非CYP酶系,對(duì)于一些需此類酶系活化的間接致突變物的檢測(cè)并不適用；S9混合液也有酶活性不穩(wěn)定和致細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化改變等缺點(diǎn),所以,S9在體外微核試驗(yàn)中暴露時(shí)間受限。為克服S9混合液的不足,在遺傳毒性機(jī)制研究中可使用表達(dá)人類生物轉(zhuǎn)化酶的細(xì)胞系來(lái)代替細(xì)胞外代謝活化系統(tǒng)。為了印證文獻(xiàn)報(bào)道的斷裂劑和致非整倍體劑對(duì)染毒時(shí)程的不同選擇性。本課題的第一部分是采用已知的染色體斷裂劑(絲裂霉素C和博來(lái)霉素)和致非整倍體劑(秋水仙堿和長(zhǎng)春花堿)對(duì)中國(guó)地鼠肺成纖維(V79)細(xì)胞染毒,染毒方案分別采取以下不同暴露／恢復(fù)時(shí)程：0h／24h(陰性對(duì)照)、3h/21h、6h/18h、 12h/12h、18h/6h和24h／0h,然后檢測(cè)各組微核細(xì)胞率。然而,重組表達(dá)生物轉(zhuǎn)化酶的受試細(xì)胞對(duì)間接致突變物的代謝活化是一個(gè)可能出現(xiàn)酶蛋白飽和現(xiàn)象及需要時(shí)間的過(guò)程,其是否影響暴露／恢復(fù)時(shí)程與所測(cè)試受試物微核形成機(jī)制的特定關(guān)系則尚無(wú)報(bào)道。本課題的第二部分則使用共表達(dá)人CYP2E1酶和人硫酸基轉(zhuǎn)移酶(SULT) 1A1酶的重組中國(guó)地鼠肺成纖維(V79)細(xì)胞(V79-hCYP2E1-hSULT1A1)來(lái)初步探討數(shù)種需生物轉(zhuǎn)化酶代謝活化的外源化學(xué)物的遺傳毒作用機(jī)制。其中,卜甲基芘經(jīng)CYP2E1酶和SULT1A1酶先后兩步生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)而活化,1-羥甲基芘經(jīng)SULT1A1酶活化形成致突變物(二者未經(jīng)代謝活化均無(wú)遺傳毒性)；氫醌、兒茶酚和1,2,4-三羥基苯則被CYP2E1酶活化成活性增強(qiáng)的致突變物。微核試驗(yàn)方法同以上第一部分,探討暴露／恢復(fù)時(shí)程對(duì)這些受試物誘發(fā)微核作用的影響,此外還分析各受試物誘導(dǎo)細(xì)胞有絲分裂阻滯的作用(作為微管毒性的標(biāo)志),為判斷受試物可能的遺傳毒作用機(jī)制(斷裂劑或致非整倍體劑)提供線索。多氯聯(lián)苯(Polychlorinated biphenyls, PCBs)是一組持久性有機(jī)污染物,至今仍普遍存在于全球環(huán)境中,且在高暴露人群體內(nèi)有一定量的蓄積。2013年國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)己把PCBs確認(rèn)為人類致癌物。CYP2E1是一個(gè)主要在肝臟表達(dá)的重要生物轉(zhuǎn)化酶,可催化許多小分子外源化學(xué)物的代謝,包括苯、苯酚及某些短鏈鹵代脂肪烴等化學(xué)物。本課題組以微核試驗(yàn)和1Hpγt基因突變?cè)囼?yàn)為遺傳學(xué)終點(diǎn)的前期研究發(fā)現(xiàn),低氯化多氯聯(lián)苯經(jīng)人CYP2E1代謝活化成為具有遺傳毒性的代謝物,其作用明顯強(qiáng)于另外幾個(gè)CYP酶。小鼠是一個(gè)毒理學(xué)試驗(yàn)中常用的動(dòng)物種屬,但是小鼠CYP2E1酶對(duì)PCBs的代謝活化作用未見報(bào)道。為進(jìn)一步探討CYP2E1酶對(duì)PCBs代謝活化能力的種屬差異性,本課題選取前期研究中以不同(遞減)強(qiáng)度誘發(fā)V79-hCYP2E1-hSULT1A1細(xì)胞微核形成的4種PCB化合物(PCB 20、PCB 18、PCB 5和PCB 28),N-亞硝基二甲基胺(N-nitrosodimethylamine, NDMA,依賴于CYP2E1活化的強(qiáng)致突變物)作為參考性己知間接致突變物探討這5種化學(xué)物誘發(fā)表達(dá)小鼠CYP2E1酶的V79重組細(xì)胞(V79-mCYP2E1)和V79-hCYP2E1-hSULT1A1細(xì)胞Hprt基因座突變作用,比較兩個(gè)種屬CYP2E1酶代謝活化作用的選擇性和活化強(qiáng)度的差異,以期為相關(guān)動(dòng)物試驗(yàn)的物種選擇提供依據(jù)。目的1.印證不同外源化學(xué)物誘發(fā)哺乳動(dòng)物細(xì)胞微核形成所需敏感的暴露／恢復(fù)時(shí)程與微核形成機(jī)制(斷裂作用與致非整倍體作用)之間的關(guān)系。2.研究需經(jīng)生物轉(zhuǎn)化酶代謝活化的幾個(gè)外源化學(xué)物在不同暴露／恢復(fù)時(shí)程條件下誘導(dǎo)重組表達(dá)生物轉(zhuǎn)化酶的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系微核的作用,從而明確代謝環(huán)節(jié)是否構(gòu)成對(duì)微核形成的時(shí)程毒理學(xué)的影響,以及相關(guān)間接遺傳毒物作用的可能機(jī)制。3.探討人和小鼠兩個(gè)種屬的CYP2E1酶分別對(duì)NDMA和4種PCBs誘發(fā)基因突變的作用,以闡明這兩個(gè)種屬的CYP2E1對(duì)PCBs代謝活化作用的相似度或差異性。方法1.細(xì)胞增殖／存活測(cè)定(CCK-8試驗(yàn))CCK-8試驗(yàn)方法是測(cè)定細(xì)胞增殖和活性的常用方法。CCK-8試劑含有WST-8(2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽),其在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鮪硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)的作用下被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物(Formazandye)。生成的甲瓚物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比,通過(guò)酶標(biāo)儀于450nm處測(cè)定光密度(Optical density, OD)而定量。本研究中以各受試物處理V79和V79-hCYP2E1-hSULT1A1細(xì)胞的暴露／恢復(fù)時(shí)程按照以下方案進(jìn)行：0h／24h(陰性對(duì)照),3h/21h,6h/18h,12h/12h,18h/6h和24h／0h。加入CCK-8試劑后用酶標(biāo)儀于450nm波長(zhǎng)檢測(cè)溶液光密度,以各暴露組與對(duì)照組光密度的比較表示細(xì)胞增殖／存活率。2.微核試驗(yàn)微核試驗(yàn)是檢查細(xì)胞染色體可遺傳改變的一種遺傳毒性試驗(yàn)方法。V79細(xì)胞和V79-hCYP2E1-hSULT1A1細(xì)胞接種24h后進(jìn)行染毒,暴露／恢復(fù)時(shí)程與CCK-8試驗(yàn)方法相符。選擇受試化合物濃度的原則：多數(shù)暴露／恢復(fù)時(shí)程條件下微核細(xì)胞率增高具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,同時(shí)細(xì)胞毒作用盡量低或完全沒有；每個(gè)受試物設(shè)置2個(gè)相差一倍的濃度。對(duì)于受試物可被SULT1A1代謝減毒(氫醌、兒茶酚及三羥基苯)的試驗(yàn),V79-hCYP2E1-hSULT1A1細(xì)胞以SULT1抑制劑五氯酚(PCP)處理(染毒前2h加入并一直存在于培養(yǎng)液中,直至細(xì)胞收獲)。各培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞以胰蛋白酶消化的方式收獲,經(jīng)過(guò)低滲、固定、滴片,最后用姬姆薩染液染色。每個(gè)處理組設(shè)2個(gè)重復(fù)試驗(yàn),在光學(xué)顯微鏡油鏡下每個(gè)試驗(yàn)隨機(jī)觀察1000個(gè)完整細(xì)胞,計(jì)數(shù)至少含一個(gè)微核的細(xì)胞數(shù),以獲得微核細(xì)胞率。3.有絲分裂細(xì)胞率的分析細(xì)胞紡錘體損傷的一個(gè)突出表現(xiàn)就是有絲分裂阻滯,即細(xì)胞增殖不受明顯影響的情況下出現(xiàn)的細(xì)胞有絲分裂頻率增高。細(xì)胞接種于放置4.5cm2圓形爬片的6孔板中,于24h染毒,受試物為氫醌、兒茶酚或三羥基苯時(shí)1CP(10μM)于染毒前2h加入,直至染毒結(jié)束。細(xì)胞經(jīng)固定,以姬姆薩染色液染色,然后將爬片倒扣于載玻片。每組設(shè)置2個(gè)重復(fù)樣本。光學(xué)顯微鏡油鏡下每個(gè)試驗(yàn)隨機(jī)觀察1000個(gè)完整細(xì)胞,計(jì)數(shù)有絲分裂期細(xì)胞并計(jì)算其所占比例,即有絲分裂細(xì)胞率。4.SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)及免疫印跡(Western Blot)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和免疫印跡是蛋白質(zhì)電泳分離和定量分析的常用方法。實(shí)驗(yàn)流程如下：制備蛋白樣品(BCA法測(cè)蛋白濃度)、SDS-PAGE(上樣量為50μg蛋白質(zhì)、容量1mL)、電轉(zhuǎn)移(冰浴轉(zhuǎn)膜)、封閉、一抗孵育(4℃)、TBST洗滌、二抗孵育(常溫)、TBST洗滌、電化學(xué)顯色反應(yīng)、分析。5. Hprt基因座致突變?cè)囼?yàn)細(xì)胞在Hprt(次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶)位點(diǎn)的正向突變(即獲得對(duì)6-巰基嘌呤的抗性)是其所觀察的遺傳毒作用終點(diǎn)。細(xì)胞以1.5×106個(gè)/瓶(182cm2,25mL培養(yǎng)液)的密度接種,24h后,加入各受試化合物,染毒24h后換液。繼續(xù)培養(yǎng)2d后,以胰蛋白酶消化收集細(xì)胞(各組細(xì)胞數(shù)占對(duì)照組細(xì)胞數(shù)的百分比作為受試物細(xì)胞毒性的指標(biāo))后以1×106個(gè)/皿(137cm2,25mL培養(yǎng)液)密度傳代。進(jìn)一步培養(yǎng)3d后,再一次傳代并以5×105個(gè)/皿的密度接種細(xì)胞于含有6-巰基嘌呤(7μg/mL)的選擇性培養(yǎng)液(每個(gè)培養(yǎng)皿收集的細(xì)胞傳代于含選擇性培養(yǎng)液的4個(gè)培養(yǎng)皿)；另外以100個(gè)/皿的密度接種細(xì)胞于3個(gè)含正常培養(yǎng)液的9.6 cm2培養(yǎng)皿,以測(cè)定細(xì)胞的集落形成率。8d后試驗(yàn)終止,經(jīng)固定和姬姆薩染色,計(jì)數(shù)每個(gè)培養(yǎng)皿細(xì)胞集落的數(shù)目,以平行接種的各培養(yǎng)皿所得均數(shù)作為相應(yīng)的觀察值(集落形成率和突變細(xì)胞率)。6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析CCK-8試驗(yàn)采用方差分析法對(duì)不同處理組與對(duì)照組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)。微核試驗(yàn)和有絲分裂細(xì)胞率分析試驗(yàn)中每個(gè)處理組設(shè)有2個(gè)重復(fù)測(cè)試,組內(nèi)數(shù)據(jù)合并后采用χ2檢驗(yàn)對(duì)不同處理組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)。Hprt基因突變?cè)囼?yàn)中各處理組與對(duì)照組突變細(xì)胞率的比較采用Fisher確切概率法。所有統(tǒng)計(jì)結(jié)果以P0.05判斷為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1.斷裂劑絲裂霉素C (MMC)和博萊霉素(BLM)誘發(fā)V79細(xì)胞微核的作用隨暴露／恢復(fù)時(shí)程變化呈現(xiàn)雙相反應(yīng)：首先隨著暴露時(shí)間延長(zhǎng)微核細(xì)胞率逐漸增高,于12h／12h達(dá)到峰值,然后逐漸下降。而致非整倍體劑秋水仙素(COL)和長(zhǎng)春花堿(VBL)誘發(fā)微核的作用則一直隨暴露時(shí)間延長(zhǎng)而增高,于24h／0h達(dá)最高值。此外COL和VBL可誘發(fā)V79細(xì)胞有絲分裂阻滯,而MMC和BLM無(wú)此作用；與之對(duì)應(yīng)的是前二者對(duì)細(xì)胞存活／生長(zhǎng)具有一定抑制作用,而后二者沒有明顯影響。以上結(jié)果對(duì)后續(xù)利用表達(dá)生物轉(zhuǎn)化酶細(xì)胞微核試驗(yàn)染毒過(guò)程的探索提供了適當(dāng)參考。2.與COL和VBL對(duì)V79細(xì)胞的作用類似,1-甲基芘(1-MP)和1-羥甲基芘(1-HMP)對(duì)V79-hCYP2E1-hSULT1A1細(xì)胞誘發(fā)微核的作用在暴露／恢復(fù)時(shí)程為18h／6h時(shí)達(dá)到峰值；苯的羥化代謝物對(duì)V79-hCYP2E1-hSULT1A1細(xì)胞的作用則與斷裂劑對(duì)V79細(xì)胞的作用相似：兒茶酚(CAT)和1,2,4-三羥基苯(THB)在6h／18h時(shí)誘發(fā)微核作用最強(qiáng),氫醌(HQ)作用的峰值出現(xiàn)在暴露時(shí)間稍長(zhǎng)的時(shí)程。此外,1-MP和1-HMP對(duì)V79-hCYP2E1-hSULT1A1細(xì)胞呈現(xiàn)一定細(xì)胞毒作用,且隨暴露時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng)；相反,HQ、CAT和THB則沒有明顯的細(xì)胞毒作用。并且,1-HMP和1-MP誘發(fā)V79-hCYP2E1-hSULT1A1細(xì)胞明顯的有絲分裂阻滯,而CAT、THB和HQ則無(wú)明顯作用。在各暴露／恢復(fù)時(shí)程條件下,各受試物的高劑量組誘發(fā)微核和有絲分裂阻滯的作用均強(qiáng)于低劑量組。3.蛋白印跡試驗(yàn)結(jié)果顯示,V79-mCYP2E1相比于V79-hCYP2E1-hSULT1A1細(xì)胞中CYP2E1蛋白表達(dá)水平略低。五個(gè)受試化合物對(duì)V79細(xì)胞均未誘發(fā)基因突變；然而,NDMA對(duì)V79-hCYP2E1-hSULT1A1細(xì)胞和V79-mCYP2E1細(xì)胞均強(qiáng)烈誘發(fā)基因突變,且呈明顯的濃度-效應(yīng)關(guān)系,PCB 5和PCB 18可明顯誘發(fā)V79-hCYP2E1-hSULT1A1細(xì)胞基因突變,但對(duì)V79-mCYP2E1細(xì)胞僅有微弱的致突變作用。PCB 20和PCB 28對(duì)后兩種受試細(xì)胞僅有微弱的致突變作用。結(jié)論1.與既往報(bào)道相似,不同暴露／恢復(fù)時(shí)程下,斷裂劑和致非整倍體劑誘發(fā)V79細(xì)胞微核的作用有明顯差異,分別于不同時(shí)程(12h／12h和24h／0h)達(dá)到其作用的峰值。結(jié)果提示在采用細(xì)胞系的體外微核試驗(yàn)中,短暴露／長(zhǎng)恢復(fù)時(shí)程可能有利于檢測(cè)斷裂劑的作用,而長(zhǎng)暴露／短(或零)恢復(fù)則更易檢出致非整倍體劑。2.根據(jù)以上斷裂劑和致非整倍體劑誘發(fā)培養(yǎng)細(xì)胞微核作用與暴露/恢復(fù)時(shí)程的關(guān)系,結(jié)合不同受試物對(duì)V79-hCYP2E1-hSULT1A1誘發(fā)微核及有絲分裂阻滯作用的差異,可認(rèn)為兩個(gè)烷基化芘化合物(1-HMP和1-MP)經(jīng)CYP2E1酶和／或SULT1A1酶代謝活化成為具有微管毒性及致非整倍體毒性的代謝物；而苯的羥化代謝物中,CAT和THB具有斷裂作用,HQ則可能兼有斷裂作用與致非整倍體作用。代謝活化雖有時(shí)間依賴性,但上述間接致突變物誘發(fā)微核作用的時(shí)程與直接致突變物相比并不延遲,所以細(xì)胞系微核試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)程序至少對(duì)本研究采用的細(xì)胞內(nèi)代謝活化模型是適用的。3.受試化合物對(duì)表達(dá)不同種屬CYP2E1的V79重組細(xì)胞致突變作用在強(qiáng)度和效能上的差異,特別明顯表現(xiàn)在PCB 18和PCB 5對(duì)上述兩種受試細(xì)胞致突變作用的巨大差異,這不能完全由相關(guān)生物轉(zhuǎn)化酶表達(dá)水平的差異較小來(lái)解釋,而主要與酶蛋白的種屬差異性有關(guān)。因此,小鼠作為分析PCBs遺傳毒作用的體內(nèi)試驗(yàn)?zāi)Ｐ涂赡懿⒉环咸禺愋源x活化的條件,而對(duì)于其他常用的體內(nèi)試驗(yàn)動(dòng)物模型(大鼠、兔)是否適用仍需進(jìn)一步探討。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R114

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本文編號(hào)：1312891