本文關鍵詞：用于檢測雌二醇的酶熱傳感技術研究

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【摘要】：食品安全問題目前在我國已經(jīng)成為一項非常嚴峻的社會民生問題,而其中獸藥的非法添加及濫用是引起動物性食品危害的主要原因之一。雌二醇是一種小分子甾體類激素,喂食或在皮下埋植可起到促進動物食欲、增加體重、提高蛋白轉(zhuǎn)化率、改善瘦肉比、增加產(chǎn)率等作用,因此在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中曾被廣泛應用。而美國環(huán)境保護局早在1996年就將其劃定為環(huán)境內(nèi)分泌干擾物之一,多國均對其制訂了相關限量標準,我國農(nóng)業(yè)部更明確規(guī)定雌二醇不得在動物性食品中檢出。環(huán)境內(nèi)分泌干擾物可通過食物鏈的富集作用對人體以及整個自然生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生一系列的危害,其中牛奶及乳制品中雌二醇等雌激素殘留的問題已經(jīng)嚴重威脅到了我國青少年兒童的身體健康,因此對其在食物中的殘留進行嚴格有效的監(jiān)控是十分必要的。目前用于雌二醇檢測的多為色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術,這些方法需要大型昂貴的儀器及專業(yè)人員的操作,樣品前處理復雜耗時,難以滿足食品安全現(xiàn)場快速的檢測要求。為了有效的維護食品安全、控制獸藥濫用,在此我們建立了一種高效、靈敏的用于雌二醇的酶熱傳感檢測方法并初步應用于牛奶樣品的檢測。該方法基于直接競爭法的免疫學檢測原理,同時充分發(fā)揮了酶熱傳感技術快速、簡便、特異的優(yōu)點,無需繁瑣的樣品前處理工作,獲得結果穩(wěn)定可靠。本研究的研究內(nèi)容主要從以下幾方面展開:1)雌二醇的羧基化改造、偶聯(lián)及單克隆抗體的純化由于雌二醇是小分子類物質(zhì),不便于在實驗中應用,通過加入KOH及溴乙酸,應用乙酸乙酯萃取及甲醇-氯仿重結晶對其進行了羧基化改造,并通過EDC方法與目標酶蛋白偶聯(lián)。通過核磁氫譜鑒定改造產(chǎn)物E2-3-CME,通過質(zhì)譜鑒定羧基化雌二醇與β-內(nèi)酰胺酶偶聯(lián)成功,偶聯(lián)比約為12:1。同時采取辛酸-硫酸銨鹽析法對雌二醇單克隆抗體進行了純化,通過ELISA鑒定其性質(zhì)良好并初步確定了用于下一步檢測的抗原-抗體稀釋比例。2)酶熱傳感檢測體系的優(yōu)化實驗中采用TELISA技術,使用瓊脂糖凝膠顆粒SPG作為填充酶柱的固相載體吸附雌二醇抗體,待測樣品中雌二醇與β-內(nèi)酰胺酶標記的雌二醇競爭結合抗體上的位點,通過加入β-內(nèi)酰胺酶對應底物產(chǎn)生的熱信號推算待測小分子的濃度。對實驗中所涉及的反應底物、系統(tǒng)流速、載液、再生等參數(shù)進行逐步優(yōu)化。最終確立酶熱檢測體系如下:體系溫度37℃,,底物氨芐西林(4mmol/L);抗原抗體稀釋比E2 1:200/E2-m Ab 1:16000;載液0.02mol/LPBS+2%DMSO+0.5%甘油,p H7.0;再生條件:0.1mol/LGly-Hcl+0.5mol/LNacl+1%DMSO+0.1%Triton X-100,p H2.3(變速1200u L/min×6分鐘);系統(tǒng)流速400μL/min;樣品共同孵育30min/共同進樣;進樣時間:6min30sec。以上所用的稀釋液及載液均經(jīng)0.22μm濾膜過濾、超聲除氣及37℃恒溫水浴。3)構建了用于雌二醇檢測的酶熱傳感檢測方法在系統(tǒng)優(yōu)化的基礎上繪制標準曲線,E2標準品用純DMSO溶解后進行從0到200ng/ml之間9個點的梯度稀釋,依標準程序打開酶熱傳感器,待基線平穩(wěn)后依次加樣(每次進樣量350μl)-再生-記錄峰信號;同等條件下重復試驗3次,取均值繪制標準曲線。結果標準曲線為:Y=96.4438+(6.7545-96.4438)/(1+(x/10.57676)^2.5011),R2=0.9902,IC50值:10.2ng/m L,線性檢測范圍:5.1-19.4 ng/m L,最低檢測限2.8ng/m L。在E2 12.5ng/m L濃度測定穩(wěn)定性良好,X±S:80.8±2.8mv,CV:3.4%(n=6、峰高值)。與雌激素類結構類似物雌酮、雌三醇、左炔諾孕酮及己烯雌酚依次檢測,交叉反應率均低于0.01%,特異性良好。優(yōu)化建立了一種簡易的牛奶樣品前處理方法:將液態(tài)牛奶樣品分裝后離心30分鐘,抽取中層乳清層,-20℃儲存?zhèn)溆�。獲取的牛奶樣品可順利應用于酶熱傳感設備的檢測,空白樣品基質(zhì)干擾信號可以忽略。在此基礎上繪制了基于牛奶模擬樣品的標準曲線:Y=97.91128+(2.91161-97.91128)/1+(X/0.32696)^2.32955,R2=0.9982,IC50值:0.45ng/m L,線性檢測范圍:0.24-0.79ng/m L,最低檢測限0.12ng/m L。測定加標回收率均集中在100%附近,與大型儀器LC-ESI-MS進行方法比對后具有良好的一致性。目前酶熱傳感技術較少有報道應用于農(nóng)獸藥殘留的檢測,在激素類小分子物質(zhì)的檢測方面更是空白,本研究構建了一種適用于食品安全現(xiàn)場檢測工作的快速、高效、簡便且經(jīng)濟的檢測方法,拓展了酶熱技術的應用,具有廣泛的應用及發(fā)展前景。在固定化酶柱方面引入了SPG作為檢測中吸附抗體的固相載體,既省略了固定化酶(或其它生物識別原件)的步驟,又實現(xiàn)了更換抗原-抗體對子即可更換檢測目標物的目的,從而使這一傳感技術具有了良好的通用性。通過對牛奶模擬樣品的檢測,探索出了一種快速有效的牛奶樣品前處理方法,可達到較好的檢測靈敏度和穩(wěn)定性,同時也為今后應用于其他方面食品的檢測提供了思路。實驗中獲得的檢測低限較為理想,但檢測范圍偏窄,可能與雌二醇在牛奶樣品中代謝分布的復雜性有關,在實際操作時可采取稀釋的步驟以獲取準確的檢測值,同時在下一步的研究中仍將進一步探索改進。
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R155.5

【參考文獻】

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