本文關(guān)鍵詞：以線粒體DLD蛋白為靶點研究重金屬對Leydig細胞的毒性作用分子機制

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【摘要】：目的:以線粒體蛋白二氫硫辛酰胺脫氫酶(Dihydrolipoamide dehydrogenase,DLD)為靶點,研究重金屬(鉛、鎘和錳)對睪丸間質(zhì)細胞(Leydig細胞)的毒性作用,闡明其毒理機制,為重金屬污染導(dǎo)致的男性性功能低下的治療提供實驗依據(jù)。方法:方法:采用灌胃的方式給予成年雄性SD大鼠鉛暴露(10 mg/kg和25 mg/kg),給藥時間為10 W;采用灌胃的方式給予成年雄性SD大鼠鎘暴露(5 mg/kg和25 mg/kg),給藥時間為7 W;采用腹腔注射的方式給予成年雄性SD大鼠錳暴露(5 mg/kg和10 mg/kg),給藥時間為7 W。給藥結(jié)束后,留取血液和睪丸組織進行檢測。選用重金屬鉛(100μmol/L和500μmol/L)、鎘(10μmol/L和20μmol/L)、錳(500μmol/L和1000μmol/L)作用于Leydig細胞株R2C細胞,并添加25μM的22-羥基膽固醇作為底物,24 h后收取培養(yǎng)上清和細胞。采用放射免疫法檢測血清中睪酮和培養(yǎng)上清中孕酮的含量;通過Western blotting的方法分別檢測類固醇激素合成酶的表達和c AMP-PKA/PKC-ERK1/2通路蛋白的表達及其磷酸化水平;應(yīng)用流式細胞儀技術(shù)和免疫熒光技術(shù)檢測Leydig細胞的線粒體膜電位。結(jié)果:為了驗證重金屬對DLD的下調(diào)作用,通過免疫組化和Western blotting的方法檢測細胞和睪丸組織中DLD蛋白的表達。利用si RNA干擾技術(shù),選用最佳干擾條件沉默R2C細胞中DLD的表達,用放射性免疫技術(shù)檢測細胞培養(yǎng)上清中孕酮的含量,應(yīng)用流式細胞儀技術(shù)檢測線粒體膜電位,采用Western blotting法檢測類固醇激素合成酶的表達和c AMP-PKA/PKC-ERK1/2通路相關(guān)蛋白的表達及其磷酸化水平,由此證實DLD與重金屬抑制類固醇激素分泌毒性作用機制的相關(guān)性。結(jié)果:體內(nèi)外實驗結(jié)果顯示,重金屬能抑制Leydig細胞合成類固醇激素,下調(diào)類固醇激素合成關(guān)鍵酶St AR、CYP11A1和3β-HSD的蛋白表達,使細胞線粒體膜電位下降,同時顯著下調(diào)PKA、PKC的蛋白表達和ERK1/2蛋白的磷酸化水平。不同重金屬暴露后,Leydig細胞中DLD蛋白的表達水平明顯下調(diào)。si RNA干擾技術(shù)沉默DLD表達后,R2C細胞的類固醇激素合成水平明顯下降;線粒體膜電位沒有變化;類固醇激素合成關(guān)鍵酶St AR和3β-HSD的蛋白表達也出現(xiàn)明顯的下調(diào)趨勢。更重要的是,由于DLD的表達沉默,c AMP-PKA-ERK1/2信號通路中,細胞內(nèi)c AMP水平顯著下降,PKA的表達下調(diào),ERK1/2的磷酸化水平也同步下調(diào)。結(jié)論:結(jié)論:重金屬暴露能顯著抑制DLD蛋白的表達,通過抑制c AMP/PKA-ERK1/2信號通路的活化和類固醇激素合成關(guān)鍵酶St AR、CYP11A1和3β-HSD的表達,最終抑制類固醇激素的合成。通過si RNA干擾技術(shù)沉默DLD表達后,類固醇激素合成關(guān)鍵酶St AR和3β-HSD的蛋白表達也出現(xiàn)明顯的下調(diào),類固醇激素合成信號通路c AMP-PKA-ERK1/2的活化也受到抑制,最終同樣導(dǎo)致了類固醇激素合成的下降。也就是說,在Leydig細胞中,DLD一方面可以作為c AMP上游的信號分子,調(diào)控c AMP/PKA-ERK1/2信號通路的活化,另一方面可以調(diào)控合成酶St AR和3β-HSD的蛋白表達來調(diào)節(jié)類固醇激素的合成;而重金屬下調(diào)DLD蛋白的表達使其抑制類固醇激素合成,以及對Leydig細胞產(chǎn)生毒性效應(yīng)的重要靶點。
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R114

【參考文獻】

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1 LIU Qing;GU Jian Hong;YUAN Yan;LIU Xue Zhong;WANG Ya Jun;WANG Han Dong;LIU Zong Ping;WANG Zong Yuan;BIAN Jian Chun;;Effect of Cadmium on Rat Leydig Cell Testosterone Production and DNA Integrity in vitro[J];Biomedical and Environmental Sciences;2013年09期

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本文編號：1227192