發(fā)布時間：2017-11-24 02:25

  本文關鍵詞：ROS在硫酸鎳誘導大鼠睪丸間質細胞內質網(wǎng)應激和線粒體凋亡通路中的作用

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【摘要】：目的:通過體外培養(yǎng)大鼠睪丸間質細胞,觀察硫酸鎳致大鼠睪丸間質細胞ROS水平與細胞凋亡的關系,以及內質網(wǎng)應激和線粒體凋亡通路相關蛋白表達水平的變化,探討ROS在鎳誘導大鼠睪丸間質細胞內質網(wǎng)應激和線粒體凋亡通路中的作用。方法:(1)采用0.25%膠原酶消化大鼠睪丸組織分離出睪丸間質細胞,Percoll連續(xù)梯度分離液對其進行純化,并采用貼壁培養(yǎng)法再次純化。通過3β-HSD對純化后的細胞進行純度鑒定。(2)純化后的大鼠睪丸間質細胞,給予不同濃度(0、250、500和1000μmol/L)NiSO4分別處理0、6、12和24h,通過MTT法和LDH滲漏法檢測各組細胞存活率和培養(yǎng)液中LDH活力。(3)取對數(shù)生長期間質細胞,經(jīng)自由基清除劑NAC和TEMPO提前干預1h后,再行500μmol/L NiSO4處理12h。采用DCFH-DA探針法觀察大鼠睪丸間質細胞內ROS水平,DAPI熒光染色法觀察細胞核形態(tài)學變化,Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡率。采用Western blot法檢測大鼠睪丸間質細胞內質網(wǎng)應激相關蛋白GRP78、GADD153和Caspase-12,以及線粒體凋亡通路相關蛋白Bak、Cyt C、Caspase-9和Caspase-3的表達水平。結果:(1)純化的間質細胞貼壁生長24h后,通過3β-HSD染色法鑒定,可得到純度較高的間質細胞。(2)與對照組比較,250、500和1000μmol/L NiSO4分別處理6、12和24h后,不同處理組細胞存活率均顯著下降(P0.05),細胞培養(yǎng)液中的LDH活力均顯著升高(P0.05),且隨著NiSO4處理濃度和時間的增加,細胞存活率逐漸降低,細胞培養(yǎng)液中LDH活力也逐漸升高。(3)與對照組比較,500μmol/L NiSO4處理12h組(NiSO4組)熒光顯微鏡下可見間質細胞中ROS水平明顯升高。與NiSO4組比較,經(jīng)5mmol/L NAC(NAC組)和1mmol/L TEMPO(TEMPO組)干預后,間質細胞中ROS水平明顯下降(P0.05)。DAPI熒光染色后,鏡下可見NiSO4組細胞體積變小,細胞核固縮或裂解,呈梭狀和鐮刀狀,部分染色質呈現(xiàn)濃縮狀態(tài),可見凋亡小體;NAC組細胞核可見固縮,邊緣呈梭狀,不完整;TEMPO組細胞核大多為正常圓形,少見固縮和不完整邊緣的細胞核,凋亡小體明顯減少。流式細胞術定量檢測細胞凋亡率發(fā)現(xiàn),與對照組比較,NiSO4組間質細胞凋亡率顯著增加,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。與NiSO4組比較,NAC組和TEMPO組間質細胞凋亡數(shù)量均明顯減少,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。與對照組比較,NiSO4組間質細胞內質網(wǎng)應激相關蛋白GRP78、GADD153和Caspase-12以及線粒體凋亡通路相關蛋白Bak、Cyt C、Caspase-9和Caspase-3的蛋白表達水平均升高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。與NiSO4組比較,NAC組細胞上述蛋白表達水平均下降,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),而TEMPO組除Caspase-3以外,其他蛋白表達水平顯著下調,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結論:NiSO4對大鼠睪丸間質細胞的損傷可能與其誘導間質細胞ROS大量生成和凋亡率增加有關。NiSO4可通過上調內質網(wǎng)應激和線粒體凋亡通路相關蛋白表達水平,但前述變化均可被自由基清除劑NAC和TEMPO所阻抑,表明ROS可能在硫酸鎳誘導的大鼠睪丸間質細胞內質網(wǎng)應激和線粒體凋亡通路中發(fā)揮重要作用。
【學位授予單位】：蘭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R114

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本文編號：1220716