本文關(guān)鍵詞：重組人乳鐵蛋白對一代延長試驗大鼠免疫功能及神經(jīng)行為影響的實驗研究

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【摘要】：目的:研究轉(zhuǎn)人乳鐵蛋白牛乳腺生物反應(yīng)器表達的重組人乳鐵蛋白(Recombinant human lactoferrin,rhLF)對子代大鼠免疫功能及神經(jīng)行為的影響。本研究開展了重組人乳鐵蛋白的一代延長試驗,目的是豐富重組人乳鐵蛋白的安全性評價資料,為風(fēng)險管理和風(fēng)險交流提供科學(xué)依據(jù)。方法:1.1重組人乳鐵蛋白氨基酸組成檢測及重組人乳鐵蛋白飼料成分分析運用國標(biāo)方法對重組人乳鐵蛋白進行氨基酸分析。重組人乳鐵蛋白全替換標(biāo)準(zhǔn)AIN-93G飼料中蛋白質(zhì)作為重組人乳鐵蛋白組飼料,標(biāo)準(zhǔn)AIN-93G飼料作為對照組飼料。飼料由北京華阜康飼料公司制作。由北京市營養(yǎng)源研究所對重組人乳鐵蛋白組飼料及對照組飼料進行營養(yǎng)成分檢測。1.2重組人乳鐵蛋白對子代大鼠免疫功能的影響參照一代繁殖毒性擴展試驗指南(OECD443)進行免疫功能試驗,重點研究親代大鼠在孕期和哺乳期暴露rhLF對子代大鼠免疫功能的影響,以及子代大鼠在斷乳后持續(xù)暴露rhLF對其免疫功能的影響。選擇PND0、PND21及PND56的子代大鼠進行相應(yīng)的進行免疫功能評價。SPF級11周齡Wistar大鼠,雌鼠60只,雄鼠30只,適應(yīng)環(huán)境一周后,隨機分為對照組(酪蛋白)、重組人乳鐵蛋白組,按照蛋白20%的比例摻入飼料進行全食物喂養(yǎng)。雌雄大鼠喂養(yǎng)相應(yīng)飼料兩周后進行交配,各組雌鼠在交配期、妊娠期和哺乳期繼續(xù)給予相應(yīng)飼料,子代大鼠從斷乳到處死繼續(xù)給予相應(yīng)飼料。子代大鼠pnd0(出生后第0天)每窩隨機選一只子代大鼠進行脾臟和胸腺淋巴細(xì)胞分型,保證每組20窩pnd0子代大鼠要有雌鼠10只、雄鼠10只。子代大鼠pnd4(出生后第4天),進行窩標(biāo)準(zhǔn)化,隨機剔除多余子代大鼠,調(diào)整為8只/窩,雌雄各半[4],在pnd0、7、14和21稱重。于pnd21子代大鼠斷乳時,進行淋巴細(xì)胞分型(t/b/nk,cd3/cd4/cd8),每組20窩保證pnd21檢測的子代大鼠中有雌鼠10只,雄鼠10只。子代大鼠于pnd56(出生后第56天)進行淋巴細(xì)胞分型和免疫功能評價試驗。本研究參考人用藥物免疫毒性試驗指導(dǎo)原則(ichs8),選取了血常規(guī);血生化;外周血、脾、胸腺及潘氏結(jié)淋巴細(xì)胞表型分析(cd3/cd4/cd8、t/b/nk);溶血空斑試驗(pfc);淋巴細(xì)胞增殖試驗;nk細(xì)胞活性試驗等。指標(biāo)涵蓋了體液免疫、細(xì)胞免疫和非特異性免疫。1.3重組人乳鐵蛋白對子代大鼠神經(jīng)行為的影響1.3.1子代大鼠早期生理發(fā)育組合測試子代大鼠出生后以窩為單位,在出生后特定的天數(shù)檢查子代大鼠成活率、性別比、出牙時間、耳廓分離時間、開眼時間和出毛時間等生理發(fā)育指標(biāo)。1.3.2子代大鼠早期神經(jīng)發(fā)育組合測試子代大鼠出生后以窩為單位,在出生后特定的天數(shù)檢查子代大鼠平面翻正、懸崖回避、空中翻正、前肢懸掛、聽覺驚嚇等神經(jīng)行為指標(biāo)。各發(fā)育指標(biāo)達標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)為:同窩所有子代大鼠該項指標(biāo)均達標(biāo)的天數(shù)。每組觀察20窩。1.3.3子代大鼠感覺運動測試pnd28重組人乳鐵蛋白組和對照組每窩隨機挑選1只雄鼠或雌鼠(每組10只雄性和10只雌性)進行熱板測試、轉(zhuǎn)棒測試和抓力測試。1.3.4子代大鼠學(xué)習(xí)記憶行為學(xué)測試在pnd70分別從各組(重組人乳鐵蛋白組和對照組)隨機選取的雌雄大鼠各10只(每窩隨機挑選1只雄鼠或雌鼠)進行morris水迷宮試驗,對子代大鼠學(xué)習(xí)記憶行為進行評價,觀察rhlf對子代大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響。結(jié)果1.1重組人乳鐵蛋白氨基酸含量和組成檢測及重組人乳鐵蛋白飼料成分分析對重組人乳鐵蛋白與酪蛋白(casein,cas)的17種氨基酸進行定量測定。飼料營養(yǎng)成分分析檢測結(jié)果表明,重組鐵蛋白飼料和酪蛋白飼料的主要營養(yǎng)成分含量接近。1.2重組人乳鐵蛋白對子代大鼠免疫功能的影響與對照組比較,重組人乳鐵蛋白組子代大鼠血常規(guī)、血生化和淋巴細(xì)胞分型結(jié)果未見明顯改變;溶血空斑試驗(pfc)、淋巴細(xì)胞增殖試驗及nk細(xì)胞活性試驗,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。1.3重組人乳鐵蛋白對子代大鼠神經(jīng)行為的影響1.3.1子代大鼠早期生理和神經(jīng)發(fā)育指標(biāo)子代大鼠出生后子代大鼠以窩為單位,檢查了子代大鼠早期生理發(fā)育指標(biāo)(成活率、性別比、出牙時間、耳廓分離時間、開眼時間和出毛時間)和早期神經(jīng)發(fā)育指標(biāo)(平面翻正、懸崖回避、空中翻正、前肢懸掛),檢查結(jié)果顯示,測試結(jié)果顯示rhlf組和對照組之間比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。1.3.2子代大鼠感覺運動測試選擇傷害性知覺測試(熱板試驗)、平衡能力測試(轉(zhuǎn)棒試驗)、抓力測試于pnd28對子代大鼠進行了感覺運動行為學(xué)測試,測試結(jié)果顯示rhlf組和對照組之間比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。1.3.3子代大鼠學(xué)習(xí)記憶測試通過morris水迷宮試驗,分析重組人乳鐵蛋白對子代大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響,未發(fā)現(xiàn)重組人乳鐵蛋白對子代大鼠學(xué)習(xí)記憶功能有不良影響(p0.05)。結(jié)論1.與對照組比較,重組人乳鐵蛋白組子代大鼠血常規(guī)、血生化和淋巴細(xì)胞分型結(jié)果未見明顯改變;溶血空斑試驗(pfc)、淋巴細(xì)胞增殖試驗及NK細(xì)胞活性試驗,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。在本研究條件下,重組人乳鐵蛋白對子代大鼠免疫功能未見不良影響。2.本論文結(jié)合一代繁殖毒性擴展試驗指南,研究rhLF暴露對子代大鼠神經(jīng)行為的影響,與對照組相比,未見重組人乳鐵蛋白對子代大鼠神經(jīng)發(fā)育指標(biāo)、感覺運動功能和學(xué)習(xí)記憶能力的影響具有不良影響(P0.05)。
【學(xué)位授予單位】：寧夏醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R151

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本文編號：1209303