本文關(guān)鍵詞：反式轉(zhuǎn)錄因子Nrf2在百草枯致小鼠腦組織LncRNA表達(dá)改變中的作用

  更多相關(guān)文章： 百草枯 MPTP 多巴胺能神經(jīng)元 LncRNA 表觀遺傳毒理學(xué) 神經(jīng)毒性 Nrf2 氧化應(yīng)激

【摘要】：目的探討百草枯(PQ)、1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)致小鼠中腦炓質(zhì)損害時(shí)長(zhǎng)鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA,LncRNA)和mRNA表達(dá)譜的變化情況,并比較這兩種神經(jīng)毒物所致LncRNA和mRNA表達(dá)譜改變模式;應(yīng)用Nrf2基因敲除小鼠探討反式轉(zhuǎn)錄因子Nrf2在百草枯、MPTP致小鼠中腦黑質(zhì)LncRNA和mRNA表達(dá)譜改變中的可能作用。方法(1)應(yīng)用已建立的PQ致PD模型的方法,即生理鹽水、10 mg/kg體重PQ、30 mg/kg體重MPTP染毒Nrf2(+/+)和Nrf2(-/-)ICR小鼠,取黑質(zhì)組織進(jìn)行LncRNA、mRNA芯片檢測(cè)(每組三片),分析LncRNA和mRNA表達(dá)譜變化,并通過(guò)Volcano Plot過(guò)濾,確定差異表達(dá)LncRNA和mRNA(差異倍數(shù)(FC)≥1.5且p0.05),對(duì)差異表達(dá)mRNA進(jìn)行基因本體(GO)分析和KEGG通路分析。(2)生理鹽水、5 mg/kg體重PQ、10 mg/kg體重PQ、30 mg/kg體重MPTP染毒Nrf2(+/+)和Nrf2(-/-)ICR小鼠(n=4),染毒結(jié)束后取黑質(zhì)、海馬、大腦皮層組織。LncRNA表達(dá)譜挑選出6個(gè)表達(dá)差異倍數(shù)最大的LncRNAs(NR-030777、NR-027648、AK078503、AK047865、NR-024257和uc007nsi.1),用熒光定量RT-PCR驗(yàn)證其在小鼠黑質(zhì)組織的表達(dá)及探討其在海馬、大腦皮層組織表達(dá)情況,并用熒光原位雜交(FISH)探索NR-030777、NR-027648在小鼠腦組織(海馬,黑質(zhì),大腦皮層)水平、細(xì)胞(多巴胺能神經(jīng)元和星型膠質(zhì)細(xì)胞)和亞細(xì)胞水平的分布情況及表達(dá)(n=3)。(3)用Coding-non-coding(CNC)相關(guān)分析預(yù)測(cè)上述6個(gè)LncRNA靶基因,預(yù)測(cè)到的潛在靶基因結(jié)果與mRNA芯片檢測(cè)結(jié)果比對(duì)分析,結(jié)合靶基因GO分析和pathway分析確認(rèn)潛在的可能下游靶基因。(4)應(yīng)用qRT-PCR實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)證NR_030777和NR_027648的部分靶基因mRNA表達(dá)情況。(5)免疫熒光實(shí)驗(yàn)方法定位檢測(cè)nr-030777與其同源蛋白編碼基因zfp326、nr-027648與其同源蛋白編碼基因zc3h14的共表達(dá)規(guī)律。結(jié)果(1)pq染毒小鼠后出現(xiàn)類pd樣行為異常,nrf2(-/-)小鼠表現(xiàn)更顯著;pq染毒可引起nrf2(+/+)和nrf2(-/-)小鼠黑質(zhì)lncrna和mrna表達(dá)譜改變。mptp染毒亦可引起nrf2(+/+)和nrf2(-/-)小鼠黑質(zhì)lncrna和mrna表達(dá)譜改變。(2)在nrf2(+/+)生理鹽水組黑質(zhì)、海馬、大腦皮層中,nr_024257在黑質(zhì)表達(dá)量最高;nr_030777、ak047865、uc007nsi.1在大腦皮層表達(dá)量最低;ak078503、nr_027248在此三種腦部位組織表達(dá)沒(méi)有差別。(3)應(yīng)用nrf2(-/-)和nrf2(+/+)icr小鼠,熒光定量rt-pcr驗(yàn)證6個(gè)lncrna的結(jié)果與芯片表達(dá)譜結(jié)果大體一致。(4)應(yīng)用原位雜交,可見(jiàn)lncrna_nr_027648和nr_30777在小鼠腦組織內(nèi)廣泛、大量的表達(dá),包括海馬,皮層,及中腦黑質(zhì)等,且在海馬組織的四個(gè)分區(qū)表達(dá)量沒(méi)有明顯差異。免疫熒光雙標(biāo)觀察到lncrna-nr_027648和nr_30777在多巴胺能神經(jīng)元中大量表達(dá),而在星型膠質(zhì)細(xì)胞中未見(jiàn)表達(dá)。在高倍鏡下lncrna-nr_027648和nr_30777均定位表達(dá)于多巴胺能神經(jīng)元胞質(zhì)中,而細(xì)胞核未可見(jiàn)。不同處理組小鼠黑質(zhì)組織,與nrf2(+/+)對(duì)照組相比,lncrna-nr_027648低劑量(5mg/kg)組表達(dá)略微上調(diào),高劑量組pq(10mg/kg)表達(dá)上調(diào),mptp組(30mg/kg)最大上調(diào)。與nrf2(-/-)對(duì)照組相比,10mg/kgpq或30mg/kgmptp處理nrf2(-/-)icr小鼠后,nr_027648表達(dá)上調(diào)。與nrf2(+/+)對(duì)照組相比,不同處理組nrf2(+/+)icr小鼠黑質(zhì)組織,lncrna-nr_nr_030777低劑量(5mg/kg)組和mptp組表達(dá)上調(diào),高劑量組pq(10mg/kg)表達(dá)最大。與nrf2(-/-)對(duì)照組相比,5mg/kgpq處理nrf2(-/-)icr小鼠后,nr_030777表達(dá)強(qiáng)度下調(diào);10mg/kgpq或30mg/kgmptp處理nrf2(-/-)icr小鼠后,nr_030777表達(dá)下調(diào)。陰性探針未檢測(cè)到雜交信號(hào)。(5)cnc相關(guān)分析預(yù)測(cè)uc007nsi.1,ak078503,ak047865,nr_024257,nr_030777和nr_027648共預(yù)測(cè)到1172個(gè)潛在靶基因(pcc≥0.80)。go分析結(jié)果、pathway分析結(jié)果提示:這6個(gè)lncrna潛在靶基因主要富集在ppar信號(hào)通路,p450參與外源物質(zhì)代謝及脂質(zhì)代謝等生物過(guò)程。其中cybb,zc3h14,duox1及duoxa2可能是nr_027648的下游靶基因,zfp326和cpne5可能是nr_030777的下游靶基因�？傊�,這些結(jié)果提示LncRNA可能參與PQ誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞退行性病變過(guò)程。(6)Nrf2敲除引起小鼠中腦黑質(zhì)組織中多巴胺能神經(jīng)元內(nèi)NR_030777表達(dá)下調(diào)與其同源蛋白編碼基因Zfp326可能表達(dá)量的改變及NR_027648表達(dá)下調(diào)與其同源蛋白編碼基因ZC3H14蛋白可能表達(dá)量的改變。結(jié)論(1)首次發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)PQ暴露可改變LncRNA表達(dá)譜和mRNA表達(dá)譜,這可能是參與PQ誘導(dǎo)神經(jīng)毒性的機(jī)制之一。(2)首次發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)MPTP暴露可改變LncRNA表達(dá)譜和mRNA表達(dá)譜,這可能是參與MPTP誘導(dǎo)神經(jīng)毒性的機(jī)制之一,LncRNA表達(dá)譜和mRNA表達(dá)譜改變不同于PQ引起的,但有相關(guān)。(3)轉(zhuǎn)錄因子Nrf2與LncRNAs可能存在潛在的基礎(chǔ)生理調(diào)控關(guān)系,Nrf2在PQ或MPTP引起的LncRNA表達(dá)譜變化發(fā)揮作用。即:MPTP可能是通過(guò)其與反式作用因子Nrf2之間相互作用引起在中腦炓質(zhì)LncRNA表達(dá)譜改變,其中NR_027648/cybb mRNA的途徑改變是其中結(jié)果之一,這很可能是MPTP誘導(dǎo)神經(jīng)毒性的機(jī)制之一;NR_030777/cpne5 mRNA/zfp326的途徑改變是MPTP或PQ通過(guò)其與反式作用因子Nrf2之間相互作用引起在中腦炓質(zhì)LncRNA表達(dá)譜改變結(jié)果之一;且PQ與反式作用因子Nrf2之間相互作用引起中腦炓質(zhì)LncRNA表達(dá)譜改變,這種改變依PQ劑量不同而所不同,高劑量PQ的神經(jīng)毒性中NR_030777,uc007nsi.1,AK078503,NR_027648可能起作用。(4)所發(fā)現(xiàn)的差異性表達(dá)的LncRNA及其相關(guān)下游靶基因的功能性失調(diào)在百草枯和MPTP致神經(jīng)細(xì)胞損害中的作用將進(jìn)行進(jìn)一步的基因功能實(shí)驗(yàn)研究。特別是Nrf2參與的NR_027648的下游靶基因Cybb,Zc3h14,Duox1及Duoxa2,NR_030777的下游靶基因zfp326和cpne5的調(diào)節(jié),我們正在進(jìn)行進(jìn)一步的基因功能實(shí)驗(yàn)研究。
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R114

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 靳雁斌;丁學(xué)鋒;司慧遠(yuǎn);吳彥瑞;王曉文;吳燕;范文紅;;小鼠Cpne5基因mRNA水平的表達(dá)分布及其在胚胎的表達(dá)定位[J];標(biāo)記免疫分析與臨床;2013年02期

2 王曉文;靳雁斌;景孝堂;吳燕;馬鑫;劉淑紅;范文紅;范明;;外源表達(dá)的人copine Ⅴ誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的研究[J];生物技術(shù)通訊;2006年02期

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 吳彥瑞;CPNE5對(duì)細(xì)胞凋亡的作用與機(jī)制研究[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2010年

，

本文編號(hào)：1145236