本文關(guān)鍵詞：線粒體應(yīng)激與p53轉(zhuǎn)位誘導(dǎo)肝源細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究

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【摘要】：【背景】 研究表明，酒精中毒性肝炎、病毒性肝炎、藥源性肝炎及肝癌等多種肝病都與氧化應(yīng)激有關(guān)。肝損傷的重要表現(xiàn)之一是發(fā)生肝細(xì)胞凋亡，研究肝細(xì)胞凋亡既是防治肝損傷的需要，也對(duì)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡具有借鑒意義。P53作為重要的應(yīng)激傳感器，在ROS等不利因素的刺激作用下可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞一旦出現(xiàn)氧化應(yīng)激，p53就會(huì)大量表達(dá)，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡。但是，p53是通過哪些作用因素或途經(jīng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的，目前尚不完全清楚。最近有研究發(fā)現(xiàn)，在凋亡因子刺激下，p53可能轉(zhuǎn)位到線粒體發(fā)揮作用。而線粒體作為能量生產(chǎn)場(chǎng)所，也是自由基、活性氧（ROS）衍生的主要部位，同時(shí)又可能是ROS攻擊的主要靶點(diǎn)。然而，p53和線粒體以及細(xì)胞凋亡三者之間關(guān)系如何，至今仍然還是個(gè)“謎團(tuán)”。 葡萄糖氧化酶（Glucose Oxidase，GOX），能高度專一性地催化β-D-葡萄糖與細(xì)胞內(nèi)游離的氧反應(yīng)，生成葡萄糖酸和過氧化氫（H2O2）。由于GOX的催化底物葡萄糖和氧氣在體內(nèi)含量豐富，葡萄糖氧化酶催化ROS生成體系既是細(xì)胞內(nèi)存在的常見反應(yīng)，也可以作為一個(gè)生理環(huán)境下H2O2釋放的理想模型。因此，采用GOX催化細(xì)胞內(nèi)β-D-葡萄糖以產(chǎn)生內(nèi)源性ROS，觀察p53和線粒體相關(guān)因子的變化，研究凋亡發(fā)生與調(diào)控過程，以期闡明p53參與誘導(dǎo)肝凋亡的可能機(jī)制，，為肝損傷防治研究提供新的思路。 【目的】 本項(xiàng)目通過葡糖糖氧化酶系統(tǒng)從體內(nèi)和體外水平誘導(dǎo)肝細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激，觀察細(xì)胞和線粒體中ROS水平變化；研究ROS是否能夠引起線粒體膜通道孔開放與膜電位改變，以及誘導(dǎo)p53的線粒體轉(zhuǎn)位；探討p53、線粒體應(yīng)激和肝源細(xì)胞凋亡的關(guān)聯(lián)性。具體研究目的如下： 1．觀察是否存在線粒體應(yīng)激和p53線粒體轉(zhuǎn)位，并探討二者間的關(guān)聯(lián)性。 2．研究線粒體氧化應(yīng)激過程中線粒體膜通透性和膜電位的變化。 3．探討線粒體應(yīng)激條件下p53參與肝源細(xì)胞凋亡的調(diào)控過程。 【方法】 以HepG2細(xì)胞（人肝癌細(xì)胞）和Babl/c小鼠為研究對(duì)象，實(shí)驗(yàn)分為：(A)正常對(duì)照組、(B)GOX處理組、(C)PFT+GOX組、(D)CsA+GOX組。研究肝細(xì)胞線粒體氧化應(yīng)激，線粒體膜結(jié)構(gòu)與功能破壞，p53表達(dá)和亞細(xì)胞定位及凋亡相關(guān)分子變化。同時(shí)采用p53抑制劑（Pifithrin-a， PFT）與線粒體膜通道孔抑制劑（Cyclosporine A，CsA），進(jìn)一步觀察p53對(duì)線粒體氧化應(yīng)激、線粒體膜的功能及凋亡相關(guān)因子的抑制作用；深入研究線粒體應(yīng)激與p53線粒體轉(zhuǎn)位參與調(diào)控細(xì)胞凋亡機(jī)制。 1．細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)：采用HepG2細(xì)胞系作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，利用葡萄糖+葡萄糖氧化酶ROS生成系統(tǒng)。采用免疫熒光和亞細(xì)胞蛋白免疫印跡法，研究ROS對(duì)肝細(xì)胞p53蛋白含量和亞細(xì)胞定位的影響。測(cè)定線粒體中超氧陰離子自由基清除劑MnSOD表達(dá)，并使用Mito-SOXTM為探針測(cè)定線粒體ROS的生成。測(cè)定線粒體膜電位，線粒體膜通透性改變，線粒體細(xì)胞色素c釋放，研究線粒體功能改變。提取線粒體、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，從整體和亞細(xì)胞水平分析細(xì)胞或組織中凋亡相關(guān)蛋白，如細(xì)胞色素c、bax、caspase3、caspase9、p53蛋白水平變化，以及氧化還原蛋白MnSOD變化。探討氧化應(yīng)激、p53水平、線粒體結(jié)構(gòu)功能及肝源細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系。 2．動(dòng)物水平實(shí)驗(yàn)：在完成細(xì)胞學(xué)研究的基礎(chǔ)上，采用Balb/C小鼠作為研究對(duì)象，通過小鼠尾靜脈射葡萄糖氧化酶，誘導(dǎo)小鼠肝臟的急性氧化損傷，并通過尾靜脈給予Pifithrin-α和Cyclosporine A處理，生理鹽水作為對(duì)照。主要觀察指標(biāo)如下：處理完成后，取出小鼠肝組織，測(cè)定氧化還原、p53蛋白定位、膜損傷、細(xì)胞凋亡等指標(biāo)的的變化，測(cè)定方法與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)一致。 【結(jié)果】 (1)給予一定劑量葡萄糖氧化酶處理后，HepG2細(xì)胞活力明顯降低，細(xì)胞內(nèi)ROS、MDA水平升高和GSH含量降低。MnSOD蛋白表達(dá)水平降低，Mito-SOXTM染色后線粒體超氧陰離子自由基水平顯著升高，線粒體出現(xiàn)了氧化應(yīng)激狀態(tài)。 (2) GOX處理后HepG2細(xì)胞p53表達(dá)水平明顯升高， p53大量向線粒體聚集，與以往文獻(xiàn)報(bào)道不同的是細(xì)胞核和細(xì)胞漿內(nèi)p53水平無明顯變化。 (3) GOX處理后線粒體膜電位降低和膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔開放，細(xì)胞色素c由線粒體釋放至細(xì)胞質(zhì)中， Bax也由細(xì)胞漿向線粒體聚集，caspase-9、caspase-3激活。而AnnexinV/PI雙染和TUNEL陽性率增加，表明大量細(xì)胞凋亡。 (4)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，葡萄糖氧化酶導(dǎo)致小鼠肝細(xì)胞線粒體MDA和ROS水平升高，GSH水平降低。尤其是p53水平上調(diào)并伴有線粒體轉(zhuǎn)位，抗氧化酶MnSOD表達(dá)與活性降低，肝細(xì)胞大量凋亡。 (5)給予p53抑制劑PFT（Pifithrin-α）和線粒體膜通道孔開放抑制劑CsA（Cyclosporine A）處理均可以一定程度上抑制HepG2細(xì)胞和小鼠肝臟p53的轉(zhuǎn)位，修復(fù)或減輕線粒體應(yīng)激損傷，細(xì)胞凋亡也明顯減輕。 【結(jié)論】 (1)發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性ROS誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)因子p53蛋白，并不是像文獻(xiàn)報(bào)道的那樣在細(xì)胞核發(fā)揮作用，而是通過轉(zhuǎn)位到線粒體發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用。 (2)發(fā)現(xiàn)線粒體膜通透性改變和即膜電位下降可能是引起p53出現(xiàn)線粒體轉(zhuǎn)位的重要途徑；而轉(zhuǎn)位到線粒體的p53通過調(diào)控MnSOD表達(dá)影響線粒體氧化應(yīng)激。 (3)發(fā)現(xiàn)p53可能通過兩條途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡：一方面p53調(diào)控線粒體氧化應(yīng)激，導(dǎo)致線粒體膜電位降低和膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔開放，促進(jìn)了細(xì)胞色素c由線粒體釋放至細(xì)胞質(zhì)中，同時(shí)激活caspase-9、caspase-3；另一方面調(diào)控凋亡蛋白Bax水平，Bax出現(xiàn)線粒體聚集，造成線粒體膜通透性改變。AnnexinV/PI雙染和TUNEL陽性率變化也表明細(xì)胞出現(xiàn)大量凋亡。 總之，通過GOX誘發(fā)線粒體氧化應(yīng)激，促進(jìn)p53上調(diào)表達(dá)與線粒體轉(zhuǎn)位，導(dǎo)致線粒體膜電位降低和線粒體膜通透孔開放，啟動(dòng)凋亡因子釋放，誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡。修正了以往p53調(diào)控細(xì)胞凋亡主要發(fā)生在細(xì)胞核的觀點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R114

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 ;Protective effects of cyclosporine A on T-cell dependent ConA-induced liver injury in Kunming mice[J];World Journal of Gastroenterology;2001年04期

本文編號(hào)：1141669