本文關(guān)鍵詞：對羥基苯甲酸丁酯暴露誘導(dǎo)青春期雄性大鼠生殖毒性作用和microRNA調(diào)節(jié)機(jī)制探討

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【摘要】：對羥基苯甲酸酯類物質(zhì)(Parabens,PBs)是目前世界上用途最廣、用量最大、應(yīng)用頻率最高的防腐劑之一。食入、皮膚反復(fù)涂抹或吸入接觸含有PBs的食品、日用品或其他產(chǎn)品為人群暴露的主要途徑。過去曾認(rèn)為PBs是低毒的防腐劑,但是近年來研究發(fā)現(xiàn)對其具有弱雌激素樣活性。PBs的雌激素活性的強(qiáng)弱直接取決于烷基的大小。烷基分子量越大,則其雌激素活性越強(qiáng)。研究顯示,對羥基苯甲酸丁酯(n-butylparaben, n-BP)暴露損傷雄性生殖系統(tǒng),包括睪丸重量下降、睪酮下降、精子數(shù)減少等。由于對羥基苯甲酸酯的毒性特征和毒性作用機(jī)制研究并不多,因此有必要對其毒性作用特征和毒性作用機(jī)制做深入的研究,以補(bǔ)充該類物質(zhì)的毒性數(shù)據(jù)資料,為制定衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。本研究選擇n-BP為目標(biāo)研究物質(zhì),己烯雌酚(DES)為陽性對照物,青春期暴露為模型,選用斷乳后雄性Wistar大鼠(PND21)為研究對象,染毒28天。將動物隨機(jī)分為5組,玉米油對照組；n-BP染毒組(160、400mg/kg); DES染毒組(1、10μg/kg),探究n-BP青春期暴露對雄性大鼠生殖內(nèi)分泌毒性作用特征、潛在毒性作用機(jī)制以及其與DES的異同,發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)志物。一、對羥基苯甲酸丁酯暴露對青春期雄性大鼠生殖系統(tǒng)毒性作用特征1、n-BP暴露對青春期雄性大鼠體重、臟器和生殖發(fā)育的影響該部分選用體重、臟器重量、臟器系數(shù)、肛門生殖器距離(anogenital distance, AGD)、包皮分離時間(preputial separation, PPS)為效應(yīng)終點(diǎn)。研究結(jié)果顯示,n-BP染毒組睪丸重量及睪丸系數(shù)、前列腺重量及前列腺系數(shù)降低,AGD減小,PPS發(fā)生延遲,睪丸出現(xiàn)病理改變。除體重?zé)o明顯變化外,其他一般毒性作用與陽性物質(zhì)DES基本一致。2、n-BP暴露對青春期雄性大鼠循環(huán)血及睪丸內(nèi)激素的影響該部分通過放射免疫方法對睪酮(testosterone, T)、17β-雌二醇(17p-estradiol, E2)進(jìn)行測定。研究結(jié)果顯示,n-BP暴露后,雄性大鼠循環(huán)血及睪丸內(nèi)T水平顯著降低,E：水平顯著升高。該結(jié)果與陽性物質(zhì)DES染毒相一致。3、n-BP暴露對青春期雄性大鼠精子生成的影響該部分以附睪尾精子計(jì)數(shù)和睪丸每日精子生成量為效應(yīng)指標(biāo)。研究結(jié)果顯示,n-BP暴露后,雄性大鼠附睪尾精子計(jì)數(shù)和睪丸每日精子生成量均顯著降低,該結(jié)果與陽性物質(zhì)DES相一致。二、對羥基苯甲酸丁酯暴露對青春期雄性大鼠生殖系統(tǒng)毒性作用機(jī)制1、n-BP暴露后青春期雄性大鼠激素合成與代謝障礙機(jī)制該部分通過熒光定量PCR、免疫印跡和免疫組織化學(xué)方法,對睪丸內(nèi)非受體途徑,即類固醇合成代謝途徑進(jìn)行研究。結(jié)果顯示,n-BP暴露后細(xì)胞色素P450側(cè)鏈裂解酶(cytochrome cholesterol side chain cleavage, P450scc)轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平均顯著降低,3p-羥基甾體脫氫酶(3β-hydroxysteroid dehydrogenase/isomerase,3β-HSD)的轉(zhuǎn)錄水平未見明顯改變。對雌二醇的合成代謝途徑進(jìn)行研究結(jié)果顯示,芳香化酶(Aromatase, Arom)轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平均顯著增加,磺基轉(zhuǎn)移酶(estrogen sulfotransferase, SulT1E1)轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平均顯著降低。該結(jié)果與陽性物質(zhì)DES相一致。2、n-BP暴露后青春期雄性大鼠核受體誘導(dǎo)生精障礙機(jī)制該部分通過熒光定量PCR和免疫組織化學(xué)方法,對睪丸內(nèi)核受體途徑進(jìn)行研究。結(jié)果顯示,n-BP暴露后雌激素受體α(estrogen receptor, ERa)表達(dá)水平顯著升高,而雄激素受體(androgen receptor, AR)無明顯變化。該結(jié)果與陽性物質(zhì)DES相一致。三、對羥基苯甲酸丁酯暴露后青春期雄性大鼠睪丸內(nèi)microRNA調(diào)節(jié)精子發(fā)生1、n-BP暴露后青春期雄性大鼠睪丸內(nèi)microRNA的變化特征該部分通過熒光定量PCR技術(shù)對n-BP暴露后可能參與精子發(fā)生調(diào)控的miRNA進(jìn)行研究。結(jié)果顯示,n-BP暴露miR-22顯著降低,miR-152顯著升高,miR-471顯著升高,miR-34b無顯著性變化。DES暴露后miR-152顯著升高,miR-471顯著降低,miR-22、miR-34b未見顯著性變化。2、n-BP暴露后睪丸內(nèi)miR-22, miR152參與精子發(fā)生的調(diào)節(jié)機(jī)制該部分通過熒光定量PCR技術(shù)和免疫印跡方法對重點(diǎn)研究的miRNA (miR-22,miR-152)的下游靶蛋白ERα和甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNA methltransferases, Dnmts)進(jìn)行檢測,并研究miRNA對靶蛋白的表達(dá)水平的影響。ERα的結(jié)果在第二部分第二節(jié)中已闡述。Dnmt研究結(jié)果顯示,n-BP暴露后青春期雄性大鼠Dnmt3b轉(zhuǎn)錄水平顯著降低,Dnmt1和Dnmt3b蛋白水平顯著降低;而DES染毒后Dnmts轉(zhuǎn)錄水平均未見顯著改變,Dnmt1和Dnmt3b蛋白水平顯著降低。結(jié)論n-BP暴露后青春期雄性大鼠生殖系統(tǒng)發(fā)生損傷,主要表現(xiàn)為睪酮／雌二醇平衡紊亂、睪丸出現(xiàn)病理性改變、精子發(fā)生障礙。其機(jī)制包括類固醇合成代謝酶水平異常、雌激素受體水平異常。本研究通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)首次提出了miRNA影響精子發(fā)生的潛在機(jī)制,即：n-BP暴露導(dǎo)致青春期雄性大鼠睪丸內(nèi)miR-22下調(diào),進(jìn)而促進(jìn)其下游靶蛋白ERa的表達(dá),從而加強(qiáng)了雌激素效應(yīng),豐富了雌激素影響精子生成機(jī)制的理論。另一方面,n-BP暴露導(dǎo)致青春期雄性大鼠睪丸內(nèi)miR-152上調(diào),進(jìn)而抑制其下游靶蛋白Dnmt的表達(dá),發(fā)現(xiàn)了miRNA與甲基化轉(zhuǎn)移酶共同參與雌激素活性物質(zhì)對睪丸損傷可能的機(jī)制,豐富了表觀遺傳學(xué)調(diào)控在生殖系統(tǒng)損傷中作用的理論。
【學(xué)位授予單位】：中國疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R114

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本文編號：1137772