本文關(guān)鍵詞：擬穴青蟹過敏原精氨酸激酶的抗原表位分析研究

  更多相關(guān)文章： 擬穴青蟹 精氨酸激酶 抗原表位 小鼠模型 細(xì)胞模型 噬菌體展示 變性處理

【摘要】：食物過敏作為食品安全的熱點問題在全球引起了廣泛關(guān)注,甲殼類動物是聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)公布的八大類過敏食物之一。蟹類等甲殼類水產(chǎn)品味道鮮美、營養(yǎng)豐富,是重要的水產(chǎn)資源;但隨著蟹類消費量的增加,因食用蟹類而導(dǎo)致過敏的報道也隨之增多。精氨酸激酶(Arginine kinase,AK)是存在于甲殼類和軟體類動物的泛過敏原,對其抗原表位的全面了解能夠為開發(fā)低致敏食品和甲殼類過敏疾病的診斷治療提供依據(jù)。本文首先從擬穴青蟹(Scylla paramamosain)肌肉中純化得到AK,通過體外模擬胃液降解AK,降解產(chǎn)物的免疫活性檢測結(jié)果表明其降解產(chǎn)物仍具有較強(qiáng)的免疫原性;通過高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)對AK的胃液消化產(chǎn)物進(jìn)行分離純化,得到具有Ig G/Ig E結(jié)合活性的5個肽段。分別采用天然AK和分段表達(dá)產(chǎn)物r AK1(AA:87-186)、r AK2(AA:172-265)作為抗原建立小鼠過敏模型,以確定AK抗原表位的優(yōu)勢區(qū)域,結(jié)果顯示天然AK組和r AK1組的小鼠血清特異性Ig E、Th2型細(xì)胞因子IL-4和IL-13均顯著升高,表明天然AK和r AK1能夠誘導(dǎo)小鼠過敏反應(yīng),提示r AK1為AK的抗原表位優(yōu)勢區(qū)。采用純化AK免疫新西蘭大白兔獲得兔抗擬穴青蟹AK特異性抗血清,通過Protein A柱層析得到純化的兔抗擬穴青蟹AK Ig G,以純化的Ig G為靶蛋白對噬菌體展示隨機(jī)十二肽庫進(jìn)行生物淘選,獲得與抗原特異性結(jié)合的5個肽段。利用Loca Pep軟件分析淘選出的肽段,模擬得到4個構(gòu)象表位C-AK-1(D3A4K43M1A5T49T44I7)、C-AK-2(L31K33V35T32E11E18F14S34D37)、C-AK-3(V177G172M173D176Q178T174L181K175L187)和C-AK-4(R202L170Y203E190P205W204L187T206Y145),以及關(guān)鍵氨基酸依次為D3,K33,T174和W204。根據(jù)噬菌體展示淘選結(jié)果設(shè)計合成了19個重疊肽段,利用甲殼類過敏患者血清檢測發(fā)現(xiàn)與血清Ig G特異識別結(jié)合的7個肽段(AA:113-127,127-141,134-148,141-155,204-218,211-225和316-330)和與血清Ig E特異識別結(jié)合的6個肽段(AA:113-127,127-141,141-155,204-218,211-225和316-330)。進(jìn)一步通過肥大細(xì)胞(RBL-2H3)脫顆粒實驗確定AK的4個線性表位:L-AK-1(AA:113-127),L-AK-2(AA:127-141),L-AK-3(AA:141-155)和L-AK-1(AA:204-218)。利用十二烷基磺酸鈉(SDS)、β-巰基乙醇(β-Me)、二硫蘇糖醇(DTT)、尿素和鹽酸胍等變性劑處理天然AK,通過免疫印跡檢測變性處理后AK的Ig E結(jié)合活性變化,結(jié)果表明AK的致敏性依賴于其空間構(gòu)象的完整性,存在于分子內(nèi)部的二硫鍵Cys201-Cys271對于維持AK的空間構(gòu)象具有關(guān)鍵作用,是影響AK致敏性的關(guān)鍵位點。綜上,本研究對擬穴青蟹AK的抗原表位進(jìn)行了定位分析,確定了AK致敏性的關(guān)鍵位點及其構(gòu)效關(guān)系,這些結(jié)果為開發(fā)低致敏食品和預(yù)防治療過敏性疾病提供理論指導(dǎo)。
【關(guān)鍵詞】：擬穴青蟹 精氨酸激酶 抗原表位 小鼠模型 細(xì)胞模型 噬菌體展示 變性處理
【學(xué)位授予單位】：集美大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R155.5
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 主要符號表11-12
• 第1章 引言12-19
• 1.1 過敏性疾病與食物過敏12-13
• 1.2 食物過敏原13-14
• 1.2.1 常見食物過敏原13
• 1.2.2 水產(chǎn)品過敏原13-14
• 1.3 過敏原的抗原表位類型14-15
• 1.3.1 構(gòu)象表位14-15
• 1.3.2 線性表位15
• 1.4 過敏原的抗原表位研究方法及進(jìn)展15-18
• 1.4.1 抗原表位的分析方法15-17
• 1.4.2 噬菌體展示隨機(jī)肽庫在抗原表位分析中的應(yīng)用17
• 1.4.3 水產(chǎn)品過敏原的抗原表位研究進(jìn)展17-18
• 1.5 本研究的目的與意義18-19
• 第2章 材料與方法19-33
• 2.1 材料19-24
• 2.1.1 動物19
• 2.1.2 血清19
• 2.1.3 主要儀器設(shè)備19-20
• 2.1.4 主要試劑20-21
• 2.1.5 實驗所用溶液及配制方法21-24
• 2.2 實驗方法24-33
• 2.2.1 擬穴青蟹精氨酸激酶的純化和鑒定24-26
• 2.2.2 AK的酶解與酶解產(chǎn)物免疫活性分析26-27
• 2.2.3 Balb/c小鼠過敏模型建立27-29
• 2.2.4 噬菌體展示肽庫的生物淘選及生物信息學(xué)分析29-31
• 2.2.5 重疊肽的設(shè)計合成及免疫活性分析31-32
• 2.2.6 活性肽段的細(xì)胞脫顆粒實驗32
• 2.2.7 AK的變性處理32
• 2.2.8 統(tǒng)計分析32-33
• 第3章 結(jié)果與分析33-53
• 3.1 擬穴青蟹AK的純化和鑒定33-34
• 3.2 擬穴青蟹AK的酶解及酶解產(chǎn)物的免疫活性分析34-36
• 3.2.1 AK的酶法降解34
• 3.2.2 AK酶解產(chǎn)物的分離純化及免疫活性分析34-36
• 3.3 擬穴青蟹AK主要抗原表位區(qū)域的確定36-40
• 3.3.1 AK分段表達(dá)產(chǎn)物的純化和鑒定36-37
• 3.3.2 AK分段表達(dá)產(chǎn)物的小鼠模型的建立37-40
• 3.4 擬穴青蟹AK構(gòu)象表位的確定40-46
• 3.4.1 噬菌體展示肽庫的生物淘選40-44
• 3.4.2 LocaPep模擬AK構(gòu)象表位44-46
• 3.5 擬穴青蟹AK線性表位的確定46-51
• 3.5.1 合成肽的免疫活性分析46-49
• 3.5.2 活性肽段刺激RBL-2H3 細(xì)胞脫顆粒實驗49-51
• 3.6 影響AK致敏性的關(guān)鍵位點確定51-53
• 第4章 討論53-58
• 4.1 AK的降解產(chǎn)物分析53-54
• 4.2 AK主要抗原表位區(qū)域的確定54
• 4.3 AK構(gòu)象表位的分析54-55
• 4.4 AK線性表位的分析55-56
• 4.5 AK致敏性的關(guān)鍵位點分析56-58
• 第5章 結(jié)論與展望58-59
• 致謝59-60
• 參考文獻(xiàn)60-67
• 在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文67

【二級參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

1 周曉秋;于廣成;王U，

本文編號：1134113