發(fā)布時間：2017-10-19 22:09

  本文關(guān)鍵詞：電離輻射在皮膚成纖維細胞WS1中誘導(dǎo)旁效應(yīng)的應(yīng)答機制研究

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【摘要】：目的:電離輻射誘導(dǎo)的旁效應(yīng)指的是未受照射細胞在接受照射細胞傳遞的信號后產(chǎn)生的生物學(xué)變化。包括旁效應(yīng)在內(nèi)的非標靶效應(yīng)改變了放射生物學(xué)的傳統(tǒng)理論而成為廣為接受的新教義。旁效應(yīng)的發(fā)生在低劑量輻射健康風(fēng)險的評估、放療的療效及對正常組織的損傷等方面可能具有重要作用,因此已成為放射生物學(xué)領(lǐng)域的一個研究熱點。目前關(guān)于旁效應(yīng)的研究主要集中在其發(fā)生的分子機制以及對機體造成的影響等方面。從旁效應(yīng)發(fā)生的過程來看,它包括信號細胞受照后啟動關(guān)鍵的信號通路,然后釋放旁效應(yīng)信號,最后受體細胞接受旁效應(yīng)信號產(chǎn)生生物學(xué)變化。本研究的主要目的是從受體細胞的角度來研究旁效應(yīng)發(fā)生的分子機制。具體說來,首先要驗證X射線是否可以在人胚胎皮膚成纖維細胞WS1中誘導(dǎo)經(jīng)培養(yǎng)液介導(dǎo)的旁效應(yīng)現(xiàn)象;然后進一步探究受α粒子照射的Ha Cat角質(zhì)細胞與未受照射的WS1細胞共培養(yǎng)后,WS1細胞是否會發(fā)生旁效應(yīng),如果發(fā)生那么WS1細胞的應(yīng)答機制又是什么,最后用Ha Cat細胞和WS1細胞簡單模擬構(gòu)建人皮膚組織模型,為在半體內(nèi)進一步深入研究電離輻射旁效應(yīng)奠定基礎(chǔ)。方法:本研究采用條件培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移和共培養(yǎng)兩種方法研究培養(yǎng)液介導(dǎo)的電離輻射旁效應(yīng)。輻射方式包括X射線和α粒子。在第一部分中,以微核形成、DNA損傷(53BP1foci)、細胞凋亡、增殖、活性氧水平和mi R-21等指標確證X射線在WS1細胞中誘導(dǎo)經(jīng)條件培養(yǎng)液介導(dǎo)的旁效應(yīng);另用ELISA法定量檢測了條件培養(yǎng)液中TGF-β1含量的變化;第二部分主要是采用克隆形成實驗和53BP1 foci免疫熒光實驗對本實驗室自行設(shè)計的用于細胞生物學(xué)實驗的新型α粒子照射裝置進行驗證。在第三部分中,以ROS水平和53BP1 foci為指標檢測與受α粒子照射的角質(zhì)細胞Ha Cat共培養(yǎng)的人皮膚成纖維細胞WS1發(fā)生的旁效應(yīng)。更重要的是,采用細胞轉(zhuǎn)染改變WS1細胞mi R-21的表達水平或通過外源性增加細胞SOD2的水平來細致地研究了旁效應(yīng)細胞中的mi R-21和SOD2在旁效應(yīng)發(fā)生中的重要作用。第四部分,以鼠尾膠原蛋白為基質(zhì),將人胚胎皮膚成纖維細胞WS1和人永生化角質(zhì)細胞Ha Cat進行立體結(jié)構(gòu)培養(yǎng),簡單模擬人體皮膚組織的構(gòu)成,并通過HE和免疫組化染色驗證三維組織的成功構(gòu)建。結(jié)果:1.X射線可在WS1細胞中誘導(dǎo)經(jīng)培養(yǎng)液介導(dǎo)的旁效應(yīng)。與新鮮培養(yǎng)液(Ctr)和未受照射條件培養(yǎng)液(SCM)對照組相比較,用1 Gy X射線照射后3小時的WS1細胞條件培養(yǎng)液(3 h RCM)處理未受照射的WS1細胞30分鐘后,旁效應(yīng)細胞中ROS水平可升高11%;3 h RCM處理旁效應(yīng)細胞1小時后,53BP1 foci陽性細胞率增加了38%;3 h RCM處理旁效應(yīng)細胞3小時后,旁效應(yīng)細胞中mi R-21的表達水平增加了1.38倍;3 h RCM處理旁效應(yīng)細胞24小時后,微核形成率增加了44%,凋亡增加近一倍。此外還發(fā)現(xiàn),與3 h SCM相比,3 h RCM中TGF-β1的含量增加了18%。在共培養(yǎng)條件下,發(fā)現(xiàn)受照細胞與未受照細胞共培養(yǎng)1 h后旁效應(yīng)細胞53BP1 foci的陽性細胞率增加了46%;共培養(yǎng)24 h后,旁效應(yīng)細胞WS1中微核形成率增加了34%。2.自行設(shè)計的α粒子照射裝置可以用于生物實驗的研究。該裝置的計算模擬劑量率為0.14 Gy/min。以WS1細胞克隆率為指標,計算得出在細胞存活率為0.5時,α粒子相對于160 Ke V的X射線的相對生物學(xué)效應(yīng)為1.71。以53BP1 foci為指標檢測直接受α粒子照射的WS1細胞DNA損傷情況,發(fā)現(xiàn)分別照射0.28 Gy、0.56 Gy后可使53BP1 foci陽性細胞數(shù)分別增加0.38倍和1倍,并且顯示出DNA損傷的非均一性。3.受α粒子照射的Ha Cat角質(zhì)細胞可在未受照WS1細胞中誘導(dǎo)經(jīng)培養(yǎng)液介導(dǎo)的旁效應(yīng),并且WS1旁效應(yīng)細胞中的mi R-21和SOD2對旁效應(yīng)的產(chǎn)生起著非常重要的調(diào)控作用。未受照射的旁效應(yīng)細胞WS1與受照射的信號細胞Ha Cat共培養(yǎng)30分鐘后,WS1細胞中ROS水平上升了15%;共培養(yǎng)3小時后,53BP1 foci(DNA損傷常用標記)增加了1.4倍,表明與照射過的角質(zhì)細胞Ha Cat共培養(yǎng)后,旁效應(yīng)細胞WS1中發(fā)生了氧化應(yīng)激和DNA損傷。并且,與受照Ha Cat細胞共培養(yǎng)3小時后,旁效應(yīng)細胞WS1中mi R-21的表達水平升高,而在WS1細胞中下調(diào)mi R-21水平可使旁效應(yīng)現(xiàn)象消除,而僅僅單獨過表達mi R-21就可誘導(dǎo)與旁效應(yīng)類似的氧化應(yīng)激和DNA損傷。這些數(shù)據(jù)表明,本系統(tǒng)中,mi R-21在旁效應(yīng)的調(diào)控中起著重要作用。另外,Mn SOD(SOD2)也參與了對WS1細胞旁效應(yīng)的調(diào)控,過表達SOD2可解除旁效應(yīng)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和DNA損傷,提示SOD2在電離輻射誘導(dǎo)旁效應(yīng)的發(fā)生中可起到重要作用。另外,本研究還發(fā)現(xiàn)mi R-21可調(diào)控SOD2。4.構(gòu)建人皮膚組織三維模型。利用人胚胎皮膚成纖維細胞WS1和人永生化角質(zhì)細胞Ha Cat構(gòu)建了一個多細胞體系實驗?zāi)Ｐ?從而簡單地模擬了人體正常皮膚組織結(jié)構(gòu)。HE染色結(jié)果顯示Ha Cat細胞分化為層狀結(jié)構(gòu);在X射線照射后,免疫組化染色顯示的53BP1 foci證實三維皮膚組織中細胞的DNA損傷。除此之外還構(gòu)建了穩(wěn)定表達SOD2的WS1細胞株,進而可用穩(wěn)定表達SOD2的WS1細胞與Ha Cat細胞構(gòu)建三維皮膚模型。結(jié)論:本研究證實X射線可在WS1細胞中誘導(dǎo)經(jīng)培養(yǎng)液介導(dǎo)的旁效應(yīng)。并且WS1細胞還可接受受α粒子照射的Ha Cat細胞釋放的旁效應(yīng)信號從而產(chǎn)生旁效應(yīng)。從未受照射細胞的視角來看,WS1細胞中的mi R-21和SOD2對旁效應(yīng)的發(fā)生起著至關(guān)重要的作用,而且mi R-21可能通過對SOD2的調(diào)控來調(diào)控著旁效應(yīng)的發(fā)生。具體說來,受照細胞Ha Cat傳遞的旁效應(yīng)信號可上調(diào)旁效應(yīng)細胞WS1的mi R-21,而上調(diào)的mi R-21再下調(diào)SOD2的表達從而導(dǎo)致WS1細胞出現(xiàn)氧化應(yīng)激和DNA損傷的旁效應(yīng)現(xiàn)象。最后,本研究成功構(gòu)建了三維皮膚組織,為下一步在半體內(nèi)深入研究旁效應(yīng)的機制奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：電離輻射旁效應(yīng) 成纖維細胞 角質(zhì)細胞 α粒子 微核 53BP1 foci ROS miR-21 SOD2
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R144.1
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-13
• 引言13-18
• 第一部分X射線在WS1 細胞中誘導(dǎo)產(chǎn)生旁效應(yīng)18-38
• 材料18-20
• 方法20-26
• 結(jié)果26-36
• 討論36-38
• 第二部分 用于細胞生物學(xué)實驗的新型α粒子照射裝置的驗證38-45
• 材料39
• 方法39-41
• 結(jié)果41-44
• 討論44-45
• 第三部分 細胞共培養(yǎng)模型中受α粒子照射的HaCat細胞在WS1 細胞中誘導(dǎo)旁效應(yīng)的應(yīng)答機制研究45-64
• 材料45-47
• 方法47-51
• 結(jié)果51-62
• 討論62-64
• 第四部分 人皮膚組織三維模型的構(gòu)建64-74
• 材料64-65
• 方法65-70
• 結(jié)果70-73
• 討論73-74
• 結(jié)論74-75
• 參考文獻75-84
• 綜述84-96
• 參考文獻90-96
• 攻讀學(xué)位期間本人出版或公開發(fā)表的論文96-98
• 縮略詞表98-99
• 致謝99-101

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本文編號：1063595