本文關(guān)鍵詞：諾如病毒RT-PCR方法的建立及其江蘇部分地區(qū)的流行病學(xué)研究

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【摘要】：諾如病毒(Norovirus, N V)是引起非細(xì)菌性急性胃腸炎的主要病原體之一,近年來由諾如病毒引起的疫情暴發(fā)與流行逐漸增多,日益成為重要的公共衛(wèi)生問題。由于諾如病毒尚不能體外培養(yǎng),且極易發(fā)生變異,傳統(tǒng)的血清學(xué)及免疫學(xué)檢測(cè)方法存在很大局限性,目前以PCR為核心的分子生物學(xué)檢測(cè)方法成為檢測(cè)諾如病毒的主要研究方向。本研究通過建立常規(guī)RT-PCR與熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法,對(duì)水體樣品的前處理進(jìn)行研究,并運(yùn)用建立的方法對(duì)采集于江蘇部分地區(qū)的臨床、牡蠣和水體樣品進(jìn)行檢測(cè)與評(píng)價(jià),為進(jìn)一步完善諾如病毒的檢測(cè)提供依據(jù)。同時(shí)了解江蘇部分地區(qū)諾如病毒的污染狀況,分析其分子流行病學(xué)特征,為諾如病毒的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估及分子流行病學(xué)調(diào)查提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。一、諾如病毒常規(guī)RT-PCR與熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的建立及比較針對(duì)諾如病毒衣殼蛋白保守區(qū)及ORF1-ORF2連接處的基因序列設(shè)計(jì)引物、探針,優(yōu)化反應(yīng)體系,建立常規(guī)RT-PCR和熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法。運(yùn)用建立的方法對(duì)其他腸道病毒進(jìn)行檢測(cè),均無交叉反應(yīng),表明該兩種方法具有良好的特異性；不同拷貝數(shù)的諾如病毒檢測(cè)結(jié)果顯示常規(guī)RT-PCR檢測(cè)限為103 copies/μL,熒光定量RT-PCR檢測(cè)限為102copies/μL。對(duì)不同稀釋梯度含有GⅠ型、GⅡ型諾如病毒目的基因的標(biāo)準(zhǔn)重組質(zhì)粒進(jìn)行熒光定量RT-PCR反應(yīng),結(jié)果GI型標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒在102-108copies/μL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系,標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=40.585-3.301×1gX,相關(guān)系數(shù)R2達(dá)到0.997,擴(kuò)增效率Eff為100.889%；GⅡ型標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒在101～108copies/μL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系, 標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=40.666-3.229×1gX, R2達(dá)到0.996, Eff為104.039%;批內(nèi)變異系數(shù)在0.18%-0.57%之間,批間變異系數(shù)在0.71%-2.62%之間,表明熒光定量RT-PC R具有良好的重復(fù)性。運(yùn)用建立的常規(guī)RT-PCR和熒光定量RT-PCR方法對(duì)22份臨床樣品進(jìn)行同步檢測(cè),并與南通市疾病預(yù)防控制中心的檢測(cè)結(jié)果相比對(duì),常規(guī)RT-PCR敏感度、特異度分別為71.43%、100%,符合率達(dá)到90.91%；熒光定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果與南通市疾病預(yù)防控制中心完全一致。運(yùn)用建立的兩種方法進(jìn)一步對(duì)180份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè),其中常規(guī)RT-PCR陽性率為5.56%,符合率達(dá)97.22%：熒光定量RT-PCR陽性率為8.33%,符合率達(dá)100%；統(tǒng)計(jì)分析兩種方法的檢測(cè)率有顯著性差異(P0.05),并對(duì)陽性樣品測(cè)序,結(jié)果證實(shí)均為諾如病毒。二、水中諾如病毒富集方法的建立及優(yōu)化采用國內(nèi)常見的混合纖維素酯濾膜,對(duì)人為污染諾如病毒的水樣進(jìn)行病毒富集,優(yōu)化濾膜的吸附與洗脫過程,建立水體病毒富集方法。在吸附過程中對(duì)水樣pH值、多價(jià)陽離子及離子濃度進(jìn)行優(yōu)化,隨后在洗脫過程中優(yōu)化洗脫液及其pH值和濃度。研究結(jié)果顯示,在吸附水體病毒過程中,當(dāng)水樣pH值為3.5時(shí),病毒平均吸附率為28.96%,吸附效果優(yōu)于其它pH值；向水樣加入Na+、Mg2+、A13+,三種離子的平均吸附率分別48.42%、28.96%、18.28%,Na+吸附效果優(yōu)于Mg2+和Al3+；當(dāng)水樣中Na+濃度為0.2mol/L時(shí),濾膜吸附效果較好,平均吸附率高達(dá)72.15%,優(yōu)于Na+其它濃度。在洗脫濾膜過程中,1%NaPP-PB-甘氨酸-0.5%吐溫80洗脫液較好,平均洗脫率為107.85%,優(yōu)于其它洗脫液；當(dāng)NaPP的濃度為0.5%時(shí),平均洗脫率高達(dá)119.94%,優(yōu)于其它濃度的洗脫液；洗脫液的pH值為8.5、9.5、10.5、11.5時(shí),平均洗脫率分別為29.43%、113.54%、134.90%、104.52%,表明當(dāng)洗脫液的pH值為10.5時(shí),其洗脫效果優(yōu)于其它pH值。運(yùn)用建立的混合纖維素酯膜吸附-洗脫法對(duì)人為污染10�！�103 copies/μL諾如病毒液的待濾水進(jìn)行富集,通過熒光定量RT-PCR檢測(cè),發(fā)現(xiàn)10-103copies/μL諾如病毒的待濾水經(jīng)富集后,均可檢出諾如病毒,未經(jīng)富集的待濾水均未檢出諾如病毒,表明該水樣富集方法的靈敏度為待濾水中病毒量達(dá)10copies/gL三、江蘇部分地區(qū)諾如病毒分子流行病學(xué)分析在2014年1月～2014年12月間采集揚(yáng)州、南通兩地區(qū)腹瀉病人的臨床樣品648份,揚(yáng)州市翠園橋海鮮農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)、歐尚超市的牡蠣樣品136份以及市區(qū)二道河、安敦河和寶帶河中水體樣品60份,用熒光定量RT-PCR方法對(duì)上述樣品進(jìn)行諾如病毒檢測(cè)。結(jié)果顯示648份臨床樣品中,共檢測(cè)出85份陽性樣品,陽性率為13.12%。其中,揚(yáng)州地區(qū)陽性率為19.13%(57/298),南通地區(qū)陽性率為8%(28/350),揚(yáng)州地區(qū)諾如病毒的感染率顯著高于南通地區(qū)(P0.05)；14歲以下兒童感染率為18.04%(57/316),14歲以上患者感染率為8.06%(22/273),14歲以下兒童的感染率顯著高于其它人群(P0.05)；男性感染率為13.01%(38/292),女性感染率為12.30%(38/309),男、女感染率差異不顯著(P0.05)。136份牡蠣樣品中,檢測(cè)出9份陽性樣品,陽性率6.62%。其中翠園橋海鮮農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)陽性率為7.64%(5/67)；歐尚超市陽性率為5.80%(4/69),統(tǒng)計(jì)分析揚(yáng)州市兩個(gè)海鮮銷售市場(chǎng)諾如病毒感染率無顯著差異(P0.05)。60份水體樣品中,檢測(cè)出13份陽性樣品,陽性率為21.67%。其中二道河水樣陽性率為10%(2/20),安敦河水樣陽性率為20%(4/20),寶帶河水樣陽性率為35%(7/20),統(tǒng)計(jì)分析揚(yáng)州市區(qū)三道河流諾如病毒污染率無顯著差異(P0.05)�；谥Z如病毒衣殼蛋白保守區(qū)的基因序列,應(yīng)用MEGA5.0軟件對(duì)43份陽性臨床樣品和1份陽性水體樣品中諾如病毒進(jìn)行基因分型,檢出GI型諾如病毒2份,包括GI.2、GI.6亞型；GⅡ型諾如病毒42份,包括GIIA GII.6、GII.8、GII.17四種基因亞型。其中GⅡ.4亞型有32份,占所有基因型別的72.73%,并與世界流行株GII.4/2006 variant和GII.4/2010在同一分支上,同源性為97%。1份陽性水體樣品中諾如病毒與臨床樣品中的GII.4亞型同源性高達(dá)100%,說明人類諾如病毒感染與水源可能有著密切關(guān)系。同時(shí)發(fā)現(xiàn)1份GI.2/GII.8間混合感染的臨床樣品,為我國首次發(fā)現(xiàn)該兩種亞型間的混合感染。
【關(guān)鍵詞】：諾如病毒 常規(guī)RT-PCR 熒光定量RT-PCR 膜吸附-洗脫 分子流行病學(xué)
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R440;R155.5
【目錄】：

• 中文摘要2-5
• Abstract5-11
• 符號(hào)說明11-12
• 綜述諾如病毒檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展12-21
• 1 病原學(xué)12-13
• 2 流行病學(xué)13
• 3 諾如病毒檢測(cè)方法13-15
• 3.1 電鏡法13-14
• 3.2 免疫法14
• 3.3 分子生物學(xué)檢測(cè)法14-15
• 4 水及水產(chǎn)品中諾如病毒的富集方法15-17
• 4.1 水中諾如病毒的富集方法15-17
• 4.2 水產(chǎn)品中諾如病毒的富集方法17
• 5 展望17-18
• 參考文獻(xiàn)18-21
• 第一章 諾如病毒常規(guī)RT-PCR與熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的建立及比較21-35
• 1 材料21-22
• 1.1 病毒材料21
• 1.2 主要儀器與試劑21-22
• 2 方法22-25
• 2.1 諾如病毒常規(guī)RT-PCR檢測(cè)方法的建立22-23
• 2.2 諾如病毒熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的建立23-25
• 2.3 常規(guī)RT-PCR與熒光定量RT-PCR對(duì)臨床樣品的檢測(cè)及其比較25
• 2.4 數(shù)據(jù)分析25
• 3 結(jié)果25-31
• 3.1 諾如病毒常規(guī)RT-PCR檢測(cè)方法的建立25-27
• 3.2 諾如病毒熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的建立27-30
• 3.3 常規(guī)RT-PCR與熒光定量RT-PCR檢測(cè)臨床樣品中諾如病毒的比較30-31
• 4 討論31-32
• 參考文獻(xiàn)32-35
• 第二章 水中諾如病毒富集方法的建立及優(yōu)化35-44
• 1 材料35
• 1.1 病毒材料35
• 1.2 主要儀器與試劑35
• 2 方法35-37
• 2.1 水中諾如病毒富集方法的建立與優(yōu)化35-36
• 2.2 水中諾如病毒的檢測(cè)36
• 2.3 病毒回收率的計(jì)算36-37
• 3 結(jié)果37-40
• 3.1 吸附條件的優(yōu)化37-38
• 3.2 洗脫條件的優(yōu)化38-39
• 3.3 富集的靈敏度39-40
• 3.4 水中諾如病毒的檢測(cè)及分析40
• 4 討論40-42
• 參考文獻(xiàn)42-44
• 第三章 江蘇部分地區(qū)諾如病毒分子流行病學(xué)分析44-54
• 1 材料44
• 1.1 主要儀器與試劑44
• 2 方法44-46
• 2.1 臨床樣品采集與處理44
• 2.2 牡蠣樣品采集與處理44-45
• 2.3 水體樣品采集與處理45
• 2.4 不同樣品中諾如病毒的檢測(cè)45
• 2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析45
• 2.6 遺傳進(jìn)化樹分析45-46
• 3 結(jié)果46-51
• 3.1 不同樣品中諾如病毒檢測(cè)情況46
• 3.2 腹瀉患者中諾如病毒檢測(cè)情況46-48
• 3.3 牡蠣樣品中諾如病毒檢測(cè)情況48-49
• 3.4 水樣中諾如病毒檢測(cè)情況49
• 3.5 遺傳進(jìn)化樹分析49-51
• 4 討論51-52
• 參考文獻(xiàn)52-54
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表論文目錄54-55
• 致謝55-56

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1 朱毅;;朱毅談防護(hù) 怎樣讓自己不感染諾如病毒[J];生命與災(zāi)害;2014年03期

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3 李丹;唐慶娟;李兆杰;王玉明;薛勇;薛長湖;;三種分子生物學(xué)方法檢測(cè)牡蠣中諾如病毒的比較研究[J];食品科學(xué);2009年12期

4 李巧艷;吳新偉;劉于飛;伍業(yè)健;高國全;楊霞;;利用熒光RT-PCR法檢測(cè)環(huán)境水體中諾如病毒[J];中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志;2011年02期

5 張其剛;潘良文;李想;方筠;;豬胃黏蛋白偶聯(lián)磁珠和聚乙二醇富集檢測(cè)青蔥和葡萄中諾如病毒的比較研究[J];食品科學(xué);2012年16期

6 阮佳;許欣;孫成均;劉亞攀;周夢(mèng)瑩;李永新;;響應(yīng)曲面優(yōu)化-毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光快速檢測(cè)糞便中諾如病毒[J];分析試驗(yàn)室;2013年09期

7 蘇來金;周德慶;馬麗萍;曹慧慧;;貝類中諾如病毒SYBR Green I實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)方法研究[J];中國食品學(xué)報(bào);2009年06期

8 孫海波;;酒店1起諾如病毒污染引起的食源性疾病暴發(fā)調(diào)查[J];職業(yè)與健康;2012年15期

9 武娟;趙玉然;唐慶娟;王靜鳳;王玉明;李兆杰;薛勇;;諾如病毒衣殼蛋白多克隆抗體的制備及效價(jià)分析[J];食品科學(xué);2014年11期

10 秦田秀;;桂林市首起諾如病毒食物中毒事件的調(diào)查[J];中國保健營養(yǎng);2013年01期

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1 鐘文龍;傅深省;王莉;陳湘雷;朱建忠;陳茂余;楊玉芳;;一起老年精神病區(qū)諾如病毒感染暴發(fā)的調(diào)查[A];2011廣東省預(yù)防醫(yī)學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)資料匯編[C];2011年

2 張巧利;鐘新光;曾耀明;夏憲照;王曉霞;陳柏芬;;一起社區(qū)諾如病毒腹瀉爆發(fā)調(diào)查分析[A];第八屆粵港澳臺(tái)預(yù)防醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)交流會(huì)議論文匯編[C];2008年

3 曾玫;陳潔;龔四堂;徐曉華;朱朝敏;朱啟昒;;我國五所城市門診腹瀉兒童諾如病毒感染的臨床和分子流行病學(xué)監(jiān)測(cè)[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十五次全國兒科學(xué)術(shù)大會(huì)論文匯編（上冊(cè)）[C];2010年

4 薛亮;吳清平;;諾如病毒分子進(jìn)化研究進(jìn)展[A];2010第二屆中國食品安全高峰論壇論文集[C];2010年

5 鄒勇;;某中學(xué)1起諾如病毒腹瀉暴發(fā)疫情的現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查分析[A];浙江省第十九屆農(nóng)村衛(wèi)生改革與發(fā)展學(xué)術(shù)會(huì)議大會(huì)論文集[C];2011年

6 丁華;;一起涉及7所學(xué)校的Ⅰ型諾如病毒感染性腹瀉暴發(fā)調(diào)查[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第一屆全國公共衛(wèi)生學(xué)術(shù)會(huì)議暨第四屆中國現(xiàn)場(chǎng)流行病學(xué)培訓(xùn)項(xiàng)目匯編[C];2009年

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8 夏體嬌;陳照立;諶志強(qiáng);邱志剛;王景峰;金敏;王新為;李君文;;2009年秋冬季節(jié)天津市病毒性腹瀉諾如病毒檢出情況分析[A];2011年全國環(huán)境衛(wèi)生學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2011年

9 馬麗萍;姚琳;蘇來金;趙峰;周德慶;;牡蠣中諾如病毒幾種不同富集方法的比較[A];中國食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會(huì)第七屆年會(huì)論文摘要集[C];2010年

10 李丹;唐慶娟;李兆杰;王玉明;薛勇;薛長湖;;三種分子生物學(xué)方法檢測(cè)牡蠣中諾如病毒的比較研究[A];2008年中國水產(chǎn)學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要集[C];2008年

中國重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 保健時(shí)報(bào)記者 穆晶晶;感染諾如病毒別驚慌[N];保健時(shí)報(bào);2007年

2 本報(bào)記者 劉遠(yuǎn)芬;諾如病毒仍有爆發(fā)風(fēng)險(xiǎn)[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2007年

3 中國疾控中心病毒所腹瀉病研究室主任 段招軍;諾如病毒感染 并非防不勝防[N];健康報(bào);2010年

4 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院急診科主任 李俊紅 中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所研究員 張見麟;勤洗手 遠(yuǎn)離諾如病毒[N];健康報(bào);2012年

5 本報(bào)記者 金振婭;面對(duì)諾如病毒不必恐慌[N];光明日?qǐng)?bào);2012年

6 錢峰;嚴(yán)防諾如病毒疫情傳入和擴(kuò)散[N];健康報(bào);2007年

7 鄭靈巧　白瑩;北京 諾如病毒發(fā)病危險(xiǎn)上升[N];健康報(bào);2007年

8 周欣;諾如病毒感染是可以預(yù)防的[N];中國醫(yī)藥報(bào);2007年

9 張愛強(qiáng)　記者　 夏丹;阻擊諾如病毒入侵[N];煙臺(tái)日?qǐng)?bào);2007年

10 本報(bào)記者 王朝;生吃貝類當(dāng)心諾如病毒[N];保健時(shí)報(bào);2008年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 賽林濤;濟(jì)南成人諾如病毒感染及兒童輪狀與諾如病毒感染特征比較的研究[D];山東大學(xué);2014年

2 司紅麗;諾如病毒核酸熒光定量檢測(cè)及其衣殼蛋白基因重組腺病毒免疫效果的研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2006年

3 孫秀靜;1.分泌型和非分泌型母親母乳中諾如病毒抗體水平的研究 2.238例極低出生體重早產(chǎn)兒的生長速率和影響因素[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2009年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 田毅;GⅡ-4型諾如病毒P粒子制備及HBGAs相關(guān)性研究[D];華北理工大學(xué);2015年

2 楊桂華;用番茄（Solanum lycopersicum）表達(dá)口服Norovirus亞單位疫苗[D];上海交通大學(xué);2013年

3 錢明明;諾如病毒RT-PCR方法的建立及其江蘇部分地區(qū)的流行病學(xué)研究[D];揚(yáng)州大學(xué);2015年

4 孫晝;杭州地區(qū)腹瀉嬰幼兒諾如病毒感染狀況及危險(xiǎn)因素研究[D];浙江大學(xué);2010年

5 周曉紅;食品與水中諾如病毒檢測(cè)方法的建立及其在疫情暴發(fā)中的初步應(yīng)用[D];暨南大學(xué);2010年

6 桑少偉;諾如病毒急性胃腸炎分子流行病學(xué)調(diào)查研究[D];山東大學(xué);2012年

7 吳微;2010-2011年深圳市諾如病毒的分子流行病學(xué)研究[D];華中科技大學(xué);2013年

8 王瑞雪;天津地區(qū)嬰幼兒諾如病毒感染的分子流行病學(xué)特征[D];天津醫(yī)科大學(xué);2010年

9 張曉紅;北京地區(qū)成人腹瀉諾如病毒的流行和分子特征的初步研究[D];中國疾病預(yù)防控制中心;2009年

10 趙玉然;諾如病毒衣殼蛋白的原核表達(dá)與抗血清的制備[D];中國海洋大學(xué);2008年

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本文編號(hào)：1056032