本文關(guān)鍵詞：基于功能嵌合適體和外切酶Ⅲ的汞和金屬硫蛋白生物傳感研究

  更多相關(guān)文章： 金屬硫蛋白 汞 G 四聚體 分子信標(biāo) 核酸外切酶III

【摘要】：汞(mercury)是廣泛存在于自然界的一種重金屬污染物,在較低的濃度下,也能夠?qū)ι鷳B(tài)環(huán)境和人類健康造成很大的威脅,是全球最引人關(guān)注的環(huán)境污染物之一。金屬硫蛋白(metallothioneins,MTs)是一類富含半胱氨酸的低分子量、熱穩(wěn)定性和可誘導(dǎo)型金屬結(jié)合蛋白,具有重金屬解毒、自由基清除、抗輻射及抑制腫瘤等重要的生物學(xué)功能。此外,金屬硫蛋白的表達(dá)是評價(jià)環(huán)境中重金屬污染的一種關(guān)鍵性的生物標(biāo)志物。因此,建立簡便、快速、靈敏、實(shí)用的檢測汞離子和金屬硫蛋白的新方法對環(huán)境污染物監(jiān)測、職業(yè)健康風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)以及金屬硫蛋白生物學(xué)功能的研究都具有重要意義。第一章前言部分介紹了汞和金屬硫蛋白的研究意義及檢測方法,并概述了G-四聚體(G quadruplex)DNAzyme和核酸外切酶III在生物傳感領(lǐng)域的應(yīng)用。第二章建立了基于功能化的嵌合適體構(gòu)象改變雙通道比色法檢測汞和金屬硫蛋白。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的功能嵌合適體包含一段富T及富G序列,在沒有汞離子(Hg2+)存在的情況下,可以形成完整的G 四聚體,結(jié)合氯化高鐵血紅素(hemin)后具有過氧化物酶活性,能催化過氧化氫(H2O2)氧化2,2' 聯(lián)氮 二 (3 乙基苯并噻唑啉 6 磺酸)二銨鹽(ABTS)發(fā)生顯色反應(yīng)。加入Hg2+后,Hg2+特異性的識別富T序列形成t hg2+ t結(jié)構(gòu),導(dǎo)致嵌合適體發(fā)生構(gòu)象改變,不能形成g quadruplex,催化活性降低,繼而引起體系顏色和吸光度的改變。加入mts后,mts通過巰基結(jié)合hg2+生成mts hg2+復(fù)合物,促使嵌合適體向g quadruplex轉(zhuǎn)變,體系的顏色和吸光度也隨之改變。基于g quadruplex和t hg2+ t結(jié)構(gòu)的構(gòu)象轉(zhuǎn)換,我們建立了雙通道比色法測定汞和金屬硫蛋白的新方法。在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下,hg2+的濃度為8.84×10-9 1.0×10-6mol·l-1時(shí),體系的?a與hg2+濃度有良好的線性關(guān)系。線性回歸方程為?a=0.0428+0.178c(×10-7mol·l-1),r=0.9963。mts的濃度為7.22×10-9 4.62×10-7mol·l-1時(shí),體系的?a與mts濃度有良好的線性關(guān)系�；貧w方程為?a=0.0333+0.185c(×10-7mol·l-1),r=0.9995。汞和mts的檢出限分別為2.65×10-9mol·l-1和2.34×10 9mol·l-1。本文設(shè)計(jì)的方法簡單、靈敏度高、選擇性強(qiáng)、成本低,已成功應(yīng)用于尿樣中痕量mts的測定。第三章基于核酸外切酶iii熒光放大技術(shù)建立了一種簡單、快速地檢測汞離子的新方法。課題設(shè)計(jì)了一條分子信標(biāo),5’端標(biāo)記有6 羧基熒光素(6 carboxylfluorescein,6 fam)熒光基團(tuán),3’端游離出的連續(xù)3個(gè)g堿基可以猝滅5’端的熒光。當(dāng)存在汞離子時(shí),分子信標(biāo)與適體鏈通過t hg2+ t配位結(jié)合,形成3’端齊平的雙鏈dna(dsdna),可以被核酸外切酶iii識別并進(jìn)行剪切,釋放出熒光基團(tuán)、汞離子和適體鏈,而被釋放出的汞離子及適體鏈繼續(xù)和新的分子信標(biāo)雜交,“雜交 酶切 釋放”的過程不斷循環(huán),體系的熒光信號顯著增強(qiáng)。在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下,汞離子的濃度為1.0×10-9 4.68×10-8 mol·L-1時(shí),體系的?F與汞離子濃度有良好的線性關(guān)系�；貧w方程為ΔF= 82.1+30.4c(×10-9 mol·L-1),r=0.9989,檢出限為3.0×10-10 mol·L-1。該方法已經(jīng)成功應(yīng)用于水樣品中汞離子濃度的檢測,回收率為95.8% 106.9%。
【關(guān)鍵詞】：金屬硫蛋白 汞 G 四聚體 分子信標(biāo) 核酸外切酶III
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R114;TP212.3
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-13
• 主要縮寫符號與對照13-14
• 第一章 前言14-24
• 1.1 研究意義14-16
• 1.1.1 汞的污染及其危害14
• 1.1.2 金屬硫蛋白的理化性質(zhì)和生理功能14-16
• 1.2 汞和金屬硫蛋白的檢測方法16-19
• 1.2.1 汞的檢測方法16-17
• 1.2.2 MTs的檢測方法17-19
• 1.3 G quadruplex DNAzyme在生物傳感領(lǐng)域的應(yīng)用19-20
• 1.3.1 G quadruplex的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)19
• 1.3.2 基于G quadruplex DNAzyme的生物傳感方法19-20
• 1.4 核酸外切酶III信號放大技術(shù)在生物傳感領(lǐng)域的應(yīng)用20-21
• 1.5 本研究的主要內(nèi)容21-24
• 第二章 基于功能嵌合適體雙通道比色法檢測汞和金屬硫蛋白24-40
• 2.1 引言24-25
• 2.2 實(shí)驗(yàn)部分25-27
• 2.2.1 儀器與試劑25-26
• 2.2.2 檢測汞 (a) 和MTs (b) 的實(shí)驗(yàn)方法26-27
• 2.3 結(jié)果與討論27-35
• 2.3.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和生物傳感原理27-28
• 2.3.2 紫外可見吸收光譜特征和構(gòu)象轉(zhuǎn)換機(jī)制28-29
• 2.3.3 吸光度 時(shí)間曲線和圓二色譜結(jié)果分析29-30
• 2.3.4 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化30-35
• 2.4 實(shí)驗(yàn)共存物質(zhì)對Hg2+和MTs檢測的影響35-36
• 2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限及精密度36-37
• 2.6 樣品分析37-38
• 2.7 結(jié)論38-40
• 第三章 基于外切酶III輔助信號放大熒光法檢測汞40-52
• 3.1 引言40-41
• 3.2 實(shí)驗(yàn)部分41-42
• 3.2.1 儀器和試劑41-42
• 3.2.2 實(shí)驗(yàn)方法42
• 3.3 結(jié)果與討論42-50
• 3.3.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和信號放大原理42-43
• 3.3.2 熒光光譜特征和機(jī)制探討43-44
• 3.3.3 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化44-49
• 3.3.4 共存物質(zhì)的影響49-50
• 3.3.5 實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限及精密度50
• 3.4 樣品分析50-51
• 3.5 結(jié)論51-52
• 參考文獻(xiàn)52-62
• 綜述 基于T Hg~(2+) T結(jié)構(gòu)的汞生物傳感器研究進(jìn)展62-78
• 參考文獻(xiàn)74-78
• 作者攻讀學(xué)位期間的科研成果78-80
• 致謝80

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中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 ;第五屆金屬硫蛋白國際會議將于2004年10月10-13日在北京召開[J];中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào);2003年05期

2 雍政,何冰,郭軍華;硒與金屬硫蛋白的研究進(jìn)展[J];解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào);2003年04期

3 ;第五屆金屬硫蛋白(Metallothionein,MT)國際會議將于2005年10月8～12日在北京召開。[J];藥物生物技術(shù);2005年03期

4 楊在昌;鎘對小鼠肝腎中鋅分布的影響——金屬硫蛋白的作用[J];國外醫(yī)學(xué)(衛(wèi)生學(xué)分冊);1979年05期

5 王國欽;胰臟的金屬硫蛋白防止鎘對胰島素分泌的抑制[J];國外醫(yī)學(xué)(衛(wèi)生學(xué)分冊);1979年05期

6 徐兆發(fā);馮兆良;;鎘金屬硫蛋白[J];國外醫(yī)學(xué)(衛(wèi)生學(xué)分冊);1983年02期

7 陳水錦;;大鼠各組織對金屬誘導(dǎo)金屬硫蛋白合成的反應(yīng)[J];國外醫(yī)學(xué)(衛(wèi)生學(xué)分冊);1983年02期

8 金泰異;任錫麟;;金屬硫蛋白測定的進(jìn)展[J];遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);1986年01期

9 胥寶會;誘導(dǎo)金屬硫蛋白對放射線損傷的防護(hù)作用——使小鼠致死率下降[J];國外醫(yī)學(xué)(衛(wèi)生學(xué)分冊);1987年05期

10 程時(shí);;金屬硫蛋白[J];生理科學(xué)進(jìn)展;1987年04期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 雍政;何冰;徐卓立;郭軍華;;硒誘導(dǎo)金屬硫蛋白的分離、純化與鑒定[A];中國藥理學(xué)會第八次全國代表大會論文摘要集（第一部分）[C];2002年

2 蔣與剛;郭長江;高蘭興;顧景范;;鋅誘導(dǎo)金屬硫蛋白合成及其對肝臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[A];中國營養(yǎng)學(xué)會第八次全國營養(yǎng)學(xué)術(shù)會議論文摘要匯編[C];2000年

3 郭軍華;徐卓立;劉穎;賀衛(wèi)W;茹炳根;;探索一種有機(jī)硒誘導(dǎo)的新型金屬硫蛋白[A];海峽兩岸三地藥理學(xué)學(xué)術(shù)報(bào)告會論文匯編[C];2001年

4 何冰;雍政;徐卓立;郭軍華;;利用蛋白質(zhì)芯片質(zhì)譜分離純化金屬硫蛋白[A];中國藥理學(xué)會第八次全國代表大會論文摘要集（第一部分）[C];2002年

5 劉林;王建秀;;金屬硫蛋白與多肽相互作用的研究[A];中國化學(xué)會第26屆學(xué)術(shù)年會分析化學(xué)分會場論文集[C];2008年

6 耿乃志;崔燕;;金屬硫蛋白的研究進(jìn)展[A];2009年全國基層優(yōu)秀中醫(yī)表彰大會暨全國第二次民間驗(yàn)方、診療技術(shù)學(xué)術(shù)研討會會議論文集[C];2009年

7 劉樹剛;孔祥英;;鋅對幼鼠腦發(fā)育及金屬硫蛋白表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究[A];四川省營養(yǎng)學(xué)會1997年學(xué)術(shù)會議暨婦幼營養(yǎng)保健學(xué)習(xí)班專題報(bào)告及論文摘要匯編[C];1997年

8 郝守進(jìn);茹炳根;;環(huán)境中鉛的毒性及其解毒機(jī)理的研究[A];Risk Assessment of Toxic Chemicals--Proceedings of CCAST (World Laboratory) Workshop[C];2001年

9 應(yīng)晨江;;金屬硫蛋白促排鉛作用及對微量元素的影響[A];中國營養(yǎng)學(xué)會第七屆理事會青年工作委員會第三次學(xué)術(shù)會議暨微量營養(yǎng)素與慢性病青年學(xué)者高峰論壇論文集[C];2012年

10 張敬旭;符紹蓮;;金屬硫蛋白對鉛致胚胎氧化損傷的保護(hù)作用[A];第六屆全國優(yōu)生科學(xué)大會論文匯編[C];2006年

中國重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 羅梅;適量飲用茅臺酒有益于健康與金屬硫蛋白有關(guān)[N];貴州日報(bào);2005年

2 孫英威 呼濤;我國成功獲取金屬硫蛋白[N];中國鄉(xiāng)鎮(zhèn)企業(yè)報(bào);2003年

3 孫國根邋王春;應(yīng)對鎘接觸者“易感”篩選[N];科技日報(bào);2008年

4 三水;“五元一次方程”解讀茅臺[N];中華工商時(shí)報(bào);2004年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 李景喜;海藻中類金屬硫蛋白/多肽的檢測分析及對金屬誘導(dǎo)響應(yīng)研究[D];中國海洋大學(xué);2015年

2 陳偉強(qiáng);心理應(yīng)激條件下腦金屬硫蛋白的表達(dá)及其調(diào)控機(jī)制研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2004年

3 楊麗芳;金屬硫蛋白的心肌保護(hù)機(jī)制研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2014年

4 陳亮;金屬硫蛋白，金屬硫蛋白抗體與鎘致腎功能損傷[D];復(fù)旦大學(xué);2006年

5 于立博;新疆鷹嘴豆中金屬硫蛋白對鉛毒性作用的干預(yù)研究[D];新疆醫(yī)科大學(xué);2013年

6 帥怡;金屬硫蛋白抗阿霉素心臟毒性作用的基因組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)研究[D];四川大學(xué);2007年

7 常秀麗;應(yīng)答蛋白基因表達(dá)在鎘接觸中作為生物標(biāo)志物的研究[D];復(fù)旦大學(xué);2005年

8 劉秋菊;金屬硫蛋白拮抗血管緊張素Ⅱ/p53通路誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的體內(nèi)體外研究[D];吉林大學(xué);2010年

9 謝東揚(yáng);靈芝中一種DNase的特征和MT基因序列分析[D];福建農(nóng)林大學(xué);2007年

10 黃國健;金屬硫蛋白與銅抗腫瘤作用相互關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);1997年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 王洋;金屬硫蛋白檢測方法的研究[D];吉林大學(xué);2010年

2 何冰;蛋白質(zhì)表達(dá)指紋圖譜研究硒代金屬硫蛋白對放射肺損傷的防護(hù)作用[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2003年

3 吳傳松;類金屬硫蛋白產(chǎn)生菌的分離培養(yǎng)及特性研究[D];華中科技大學(xué);2009年

4 熊梅;蠅蛆轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析及Zn~(2+)對其金屬硫蛋白基因表達(dá)的影響[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

5 魏西軍;金屬硫蛋白沉默對乳腺癌轉(zhuǎn)移基因表達(dá)的影響[D];華北理工大學(xué);2015年

6 湯曉燕;金屬硫蛋白細(xì)胞表面展示提高酵母對重金屬吸附的能力[D];大連理工大學(xué);2015年

7 陳思涵;基于汞介導(dǎo)的適體信標(biāo)和金納米復(fù)合物檢測汞和MTs的新原理新方法[D];南華大學(xué);2015年

8 王同青;玉米金屬硫蛋白的表達(dá)、純化及其光譜學(xué)特性研究[D];太原理工大學(xué);2016年

9 林舒曄;人髓樣鋅指結(jié)構(gòu)1的表觀調(diào)控及其與金屬硫蛋白2A在抑制胃癌中的相互作用[D];北京交通大學(xué);2016年

10 柳大軍;融合表達(dá)人金屬硫蛋白重組乳酸菌的構(gòu)建及其預(yù)防慢性鉛中毒的應(yīng)用研究[D];暨南大學(xué);2016年

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