本文關(guān)鍵詞：煤焦瀝青煙提取物誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞惡變過程中表觀遺傳學(xué)改變

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【摘要】：目的 表觀遺傳學(xué)是不涉及DNA序列改變卻可以調(diào)控基因表達(dá)水平和功能的可遺傳的變化，包括DNA甲基化、組蛋白修飾和非編碼RNA調(diào)控；且表觀遺傳學(xué)的異常改變常發(fā)生于腫瘤形成的早期。為此，本課題以處理后煤焦瀝青煙提取物(coar tar pitch extracts，CTPE)為測試物，體外構(gòu)建人支氣管上皮細(xì)胞(humanbronchial epithelial cells, BEAS-2B)惡性轉(zhuǎn)化模型，確認(rèn)細(xì)胞惡變前提下，動態(tài)檢測不同時期細(xì)胞表觀遺傳學(xué)變化包括基因組DNA甲基化水平；DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNA methyltransferase1，DNMT1)、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3a(DNA methyltransferase3a，DNMT3a)、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3b(DNA methyltransferase3b，DNMT3b)、組蛋白去乙酰化酶1（histone deacetylase enzyme HDAC1）mRNA及蛋白表達(dá)水平；miR-21和miRlet-7a表達(dá)水平，探討CTPE致細(xì)胞惡變過程中尤其是癌前病變中表觀遺傳學(xué)分子標(biāo)志改變，為肺癌早期診斷、高發(fā)風(fēng)險(xiǎn)估計(jì)的提供更多高效標(biāo)志。 方法 據(jù)前期確定染毒劑量分為B(a)P陽性對照組、DMSO陰性對照組、煤焦瀝青煙提取物染毒組（CTPE組）建立BEAS-2B細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化模型。高效液相色譜法檢測細(xì)胞基因組甲基化水平；Real-Time PCR檢測DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、HDAC1mRNA表達(dá)量及miR-21、miRlet-7a表達(dá)量；酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、HADC1蛋白含量。 結(jié)果 1.基因組DNA甲基化水平：第10代各組細(xì)胞基因組DNA整體甲基化率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.069）；20代時B(a)P組、CTPE組甲基化率均低于DMSO組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.001；P0.001），B(a)P低于CTPE組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.042）；30代時甲基化率進(jìn)一步降低，3組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.003），B(a)P組與CTPE組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.322）。 2. DNMTs基因和蛋白表達(dá)情況：隨傳代次數(shù)增加，DMSO組DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA、蛋白表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P0.05）；而DNMT1mRNA及其蛋白在B(a)P組、CTPE組表達(dá)量逐漸升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P0.05）。DNMT3a在B(a)P組和CTPE組mRNA及其蛋白表達(dá)量均逐漸增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P0.05）。DNMT3b mRNA和蛋白在B(a)P組和CTPE組的表達(dá)量逐漸增加，B(a)P組mRNA及其蛋白差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.005；P0.001），CTPE組mRNA無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.131)，蛋白差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.001)。 3. HDAC1基因和蛋白表達(dá)情況：隨傳代次數(shù)增加，HDAC1mRNA及其蛋白在B(a)P組和CTPE組表達(dá)量均逐漸增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P0.05），DMSO組表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.997；P=0.326）。 4. miRlet-7a和miR-21基因相對表達(dá)量：隨傳代次數(shù)增加，miRlet-7a在B(a)P組和CTPE組的表達(dá)量均逐漸增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.013；P=0.002)，，DMSO組表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.996）。miR-21基因相對表達(dá)量隨傳代次數(shù)增加，B(a)P組和CTPE組的表達(dá)均逐漸增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.012；P=0.034），DMSO組表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.999）。 結(jié)論 1. CTPE誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞惡變過程與基因組DNA低甲基化，DNMTs、HDAC1、miR-21、miRlet-7a高表達(dá)有關(guān)，且通過它們之間的協(xié)同作用調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生惡變。 2. CTPE致BEAS-2B細(xì)胞惡變過程中表觀遺傳學(xué)分子可作為肺癌早期診斷及危險(xiǎn)度評價的有效生物標(biāo)志。
【關(guān)鍵詞】：煤焦瀝青煙提取物 BEAS-2B細(xì)胞 表觀遺傳學(xué) DNA甲基化HDAC miR-21 miRlet-7a
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R114
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 目錄9-11
• 圖表索引11-12
• 英文縮略詞表12-13
• 1 引言13-15
• 2 材料與方法15-28
• 2.1 材料15-18
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)對象與受試物15
• 2.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑15-16
• 2.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器16-17
• 2.1.4 主要試劑配制17-18
• 2.1.4.1 BEAS-2B 細(xì)胞培養(yǎng)所需溶液的配制17
• 2.1.4.2 基因組 DNA 甲基化所需試劑的配制17-18
• 2.1.4.3 Real-time PCR 所需試劑配制18
• 2.1.4.4 ELISA 所需試劑配制18
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法18-28
• 2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)18-19
• 2.2.2 細(xì)胞染毒及惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞株的建立19
• 2.2.3 細(xì)胞基因組甲基化水平檢測19-22
• 2.2.3.1 細(xì)胞內(nèi)總 DNA 的提取19-20
• 2.2.3.2 基因組 DNA 水解預(yù)處理20-21
• 2.2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制21
• 2.2.3.4 標(biāo)準(zhǔn)方程的建立21
• 2.2.3.5 高效液相色譜法檢測樣品21-22
• 2.2.4 Realtime-PCR 分析22-26
• 2.2.4.1 細(xì)胞總 RNA（Small RNA）提取及純度、完整性22-23
• 2.2.4.2 細(xì)胞總 RNA（small RNA）逆轉(zhuǎn)錄23-25
• 2.2.4.2.1 細(xì)胞總 RNA 逆轉(zhuǎn)錄23
• 2.2.4.2.2 Small RNA 逆轉(zhuǎn)錄23-25
• 2.2.4.3 Real-time PCR 引物的設(shè)計(jì)與合成25
• 2.2.4.4 PCR 反應(yīng)體系25-26
• 2.2.4.5 PCR 反應(yīng)條件26
• 2.2.4.6 Real-time PCR 結(jié)果分析26
• 2.2.5 ELISA 檢測 DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、HDAC1 在細(xì)胞培養(yǎng)上清中的表達(dá)26-27
• 2.2.6 統(tǒng)計(jì)分析27-28
• 3 結(jié)果28-41
• 3.1 各組細(xì)胞基因組 DNA 甲基化水平的檢測28-30
• 3.1.1 基因組提取 DNA 的完整性、純度及濃度的檢測28
• 3.1.2 高效液相色譜法測定脫氧核苷標(biāo)準(zhǔn)品分析結(jié)果28-30
• 3.2 DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、HDAC1 mRNA 水平的表達(dá)30-34
• 3.2.1 細(xì)胞提取 RNA 的完整性、純度及濃度的檢測30-34
• 3.3 DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、HDAC1 蛋白水平的表達(dá)34-37
• 3.4 miRlet-7a 和 miR-21 水平的表達(dá)37-39
• 3.5 CTPE 組第 10 代、20 代、30 代細(xì)胞 DNA 甲基化率、DNMT1、-3a、-3b、HDAC1 mRNA 、miRlet-7a、miR-21 基因相對表達(dá)量相關(guān)性分析39-41
• 4 討論41-45
• 4.1 CTPE 刺激對基因組 DNA 甲基化率的影響41-42
• 4.2 CTPE 刺激對 DNMTs 表達(dá)的影響42-43
• 4.3 CTPE 刺激對 HDAC1 表達(dá)的影響43
• 4.4 CTPE 刺激對 miRlet-7a 和 mi-21 表達(dá)水平的影響43-44
• 4.5 DNA 甲基化率、DNMT1、-3a、-3b、HDAC1、miRlet-7a、miR-21 基因相對表達(dá)量相關(guān)性分析44-45
• 5 結(jié)論45-46
• 6 參考文獻(xiàn)46-49
• 綜述49-68
• 參考文獻(xiàn)62-68
• 個人簡歷、在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與研究成果68-69
• 致謝69

【參考文獻(xiàn)】

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10 李智濤;燕貞;趙勇;王麗霞;祝寒松;王威;吳衛(wèi)東;吳逸明;;煤焦瀝青煙提取物致支氣管上皮細(xì)胞系惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞中Bub1和Mad2表達(dá)水平改變[J];中國職業(yè)醫(yī)學(xué);2010年06期

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 李智濤;煤焦瀝青煙提取物致支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B染色體不穩(wěn)定性研究[D];鄭州大學(xué);2010年

本文編號：1008356