本文關(guān)鍵詞：Cuevaenes的生物合成研究與結(jié)構(gòu)改造及ansatrienins后修飾研究

  更多相關(guān)文章： cuevaenes 安莎霉素 ansatrienins FAD-binding單加氧酶 組合生物合成

【摘要】：Cuevaenes是一類以獨(dú)特的3-羥基苯甲酸(3-hydroxybenzoic acid,3-HBA)為起始單元,由I型聚酮合酶(Polyketide Synthase, PKS)合成的線性多烯化合物,具有良好的抗菌和抗腫瘤活性。前期,本實(shí)驗(yàn)室從Streptomyces sp. LZ35中分離獲得了一系列cuevaene類化合物,并通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)定位了其生物合成基因簇,明確了分支酸水解酶Cuv10負(fù)責(zé)起始單元合成,但是其聚酮后修飾過程尚未解析。為此,本論文對(duì)cuevaenes生物合成基因簇中5個(gè)可能參與其后修飾的基因展開了研究。通過對(duì)這5個(gè)基因的敲除和回補(bǔ)實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)cmv9、cuv18和cuvl9為cuevaenes合成的必需基因,而cuv21和cuv23基因的敲除不影響cuevaenes的合成。其中Cuv18與安莎合成途徑中的保守的羥基化酶高度相似,推測(cè)其可能在聚酮鏈延伸過程中對(duì)3-HBA進(jìn)行羥基化修飾。因此,我們嘗試在體外將Cuv18與ACP形式的底物反應(yīng),但未能獲得預(yù)期產(chǎn)物。此外,為了進(jìn)一步闡明Cuv10獨(dú)特的催化機(jī)理,我們開展了Cuv10的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究,通過點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)推測(cè)了可能的催化活性位點(diǎn),遺憾的是最終未能獲得Cuv10的高分辨衍射結(jié)果。同時(shí),鑒于cuevaenes與安莎霉素的合成起始單元(3-氨基5-羥基苯甲酸,AHBA)結(jié)構(gòu)及其加載結(jié)構(gòu)域相似,我們開展了cuevaenes的結(jié)構(gòu)改造,通過將其起始單元加載結(jié)構(gòu)域替換為格爾德霉素的相應(yīng)序列,發(fā)現(xiàn)了一系列可能以AHBA為起始單元的cuevaenes類似物,仍有待目標(biāo)產(chǎn)物分離及結(jié)構(gòu)鑒定。安莎三烯(ansatrienins)是以AHBA為起始單元由I型聚酮合酶合成的安莎霉素類化合物,具有抗真菌和抗腫瘤活性。前期,本實(shí)驗(yàn)室從Streptomyces sp. XZQH13的LAL調(diào)控基因組成型表達(dá)突變株中分離獲得了安莎三烯類化合物,并開展了部分O-(N-環(huán)己甲酰)-D-丙氨�；鶄�(cè)鏈加載機(jī)制研究。本論文進(jìn)一步通過PKS基因的敲除、astC和astFl基因的回補(bǔ)、AstC的點(diǎn)突變闡明了安莎三烯的丙氨�；瘷C(jī)制。另一方面,我們開展了起始單元AHBA羥基對(duì)位的羥基化研究,發(fā)現(xiàn)cuvl8同源基因astF2基因的敲除終止了安莎三烯的產(chǎn)生,積累了中間產(chǎn)物trienomycin A和trienomycin G,提示AstF2負(fù)責(zé)AHBA羥基對(duì)位的羥基化修飾；遺憾的是,盡管進(jìn)行了多方面的嘗試,AstF2的體外功能研究未能取得成功。綜上所述,本論文發(fā)現(xiàn)了多個(gè)可能參與cuevaenes后修飾反應(yīng)的必需基因,并通過組合生物合成制造了可能的cuevaenes衍生物／線性安莎中間體,是通過結(jié)構(gòu)改造獲得新安莎的有益嘗試。此外,通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)闡明了ansatrienins的丙氨�；瘷C(jī)制,通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)明確了AstF2的羥基化酶功能,為后續(xù)安莎霉素的合成生物學(xué)改造提供了新的功能元件。
【關(guān)鍵詞】：cuevaenes 安莎霉素 ansatrienins FAD-binding單加氧酶 組合生物合成
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R914;Q78
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 符號(hào)說明及縮寫詞10-12
• 第1章 文獻(xiàn)綜述12-18
• 1.1 Cuevaenes類化合物的生物合成研究12-14
• 1.2 安莎霉素中AHBA的羥基化修飾研究14-16
• 1.3 本學(xué)位論文開展思路和研究?jī)?nèi)容16-18
• 第2章 鏈霉菌LZ35中cuevaenes的生物合成研究和結(jié)構(gòu)改造18-66
• 2.1 引言18-19
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料19-24
• 2.2.1 菌株與質(zhì)粒19
• 2.2.2 培養(yǎng)基19-20
• 2.2.3 試劑配制20-23
• 2.2.4 儀器設(shè)備23-24
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法24-33
• 2.3.1 后修飾基因敲除質(zhì)粒的構(gòu)建24-26
• 2.3.2 敲除基因回補(bǔ)質(zhì)粒的構(gòu)建26-27
• 2.3.3 大腸桿菌與鏈霉菌間的接合轉(zhuǎn)移27-28
• 2.3.4 鏈霉菌基因組DNA的提取28
• 2.3.5 突變株的驗(yàn)證與發(fā)酵產(chǎn)物的HPLC檢測(cè)28-29
• 2.3.6 蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)29
• 2.3.7 考馬斯亮藍(lán)染色膠內(nèi)酶解蛋白29-30
• 2.3.8 蛋白的分離純化30-31
• 2.3.9 Cuv10蛋白結(jié)晶條件的篩選和優(yōu)化31-32
• 2.3.10 Cuv10蛋白點(diǎn)突變的構(gòu)建32
• 2.3.11 加載結(jié)構(gòu)域的替換32-33
• 2.4 結(jié)果與討論33-63
• 2.4.1 Cuevaenes后修飾基因的功能驗(yàn)證33-38
• 2.4.1.1 五個(gè)后修飾基因的敲除33-36
• 2.4.1.2 三個(gè)后修飾基因突變株的基因回補(bǔ)36-38
• 2.4.2 Cuv18的羥基化功能驗(yàn)證38-50
• 2.4.2.1 Cuv18敲除株的體內(nèi)底物飼喂38-40
• 2.4.2.2 Cuv18與ACP形式底物的體外三步反應(yīng)40-41
• 2.4.2.3 CoA形式底物的構(gòu)建41-43
• 2.4.2.4 ACP形式底物的構(gòu)建43-47
• 2.4.2.5 Cuv18與ACP形式底物的體外催化47-50
• 2.4.3 分支酸水解酶Cuv10的催化機(jī)制研究50-58
• 2.4.3.1 Cuv10蛋白的分離純化50-51
• 2.4.3.2 Cuv10突變體構(gòu)建與酶活檢測(cè)51-53
• 2.4.3.3 Cuv10蛋白的結(jié)晶與優(yōu)化53-55
• 2.4.3.4 Cuv10穩(wěn)定條件篩選55-58
• 2.4.4 Cuevaenes的結(jié)構(gòu)改造58-63
• 2.4.4.1 Cuevaenes的加載結(jié)構(gòu)域替換58-61
• 2.4.4.2 加載結(jié)構(gòu)域替換株中cuevaenes合成的阻斷61-62
• 2.4.4.3 加載結(jié)構(gòu)域突變株差異產(chǎn)物的提取條件摸索62-63
• 2.5 總結(jié)與展望63-66
• 第3章 鏈霉菌XZQH13中ansatrienins后修飾基因功能研究66-80
• 3.1 引言66
• 3.2 實(shí)驗(yàn)材料66-67
• 3.2.1 菌株、質(zhì)粒與培養(yǎng)基66-67
• 3.2.2 試劑與儀器67
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法67-70
• 3.3.1 后修飾基因astF2和PKS的敲除67
• 3.3.2 后修飾基因的回補(bǔ)67-68
• 3.3.3 AstC突變體的構(gòu)建68
• 3.3.4 AstF2突變株差異產(chǎn)物分離與鑒定68-69
• 3.3.5 鏈霉菌細(xì)胞總蛋白的制備69
• 3.3.6 XZQH13OE中高表達(dá)AstF2蛋白69-70
• 3.4 結(jié)果與討論70-78
• 3.4.1 AStD1的敲除及astC和astF1敲除株的回補(bǔ)70-72
• 3.4.2 AstC的體外功能研究72-74
• 3.4.3 AstF2的功能研究74-78
• 3.4.3.1 AstF2基因的敲除和回補(bǔ)74-75
• 3.4.3.2 AstF2突變株差異產(chǎn)物的分離鑒定75-76
• 3.4.3.3 AstF2的體外酶活76-78
• 3.5 總結(jié)與展望78-80
• 附錄80-84
• 參考文獻(xiàn)84-88
• 致謝88-90
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄90-91
• 學(xué)位論文評(píng)閱及答辯情況表91

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本文編號(hào)：539489